气相色谱法分析啤酒中5种高级醇的方法研究

（长春职业技术学院，吉林长春130033）

啤酒作为一种低酒精度的饮品，因其具有良好的风味、丰富营养及良好的口感而深受消费者喜爱。但是，啤酒存在着饮后出现头痛、头晕的现象，造成该现象的主要原因是由于啤酒中高级醇所导致[1－2]。啤酒中高级醇主要包含正丙醇、正丁醇、异丁醇、异戊醇等[3]，它由原料中糖代谢通过丙酮酸的合成以及发酵过程中氨基酸降解代谢而形成[4－5]。高级醇是啤酒重要风味成分之一，适量的高级醇能促进酒类具有丰满的香味和口味，并增加酒的协调性。若啤酒中不含或少含高级醇，会使酒味淡薄，酒体不丰满。然而高级醇过量存在不单是酒主要异杂味的来源之一[6－9]，而且也会对人体产生危害，常常会使人产生头痛、恶心、呕吐等，对人体的眼、鼻也有刺激作用，其毒性随着分子量的增大而增加[10－13]。鉴于高级醇在啤酒中的重要性质，测定啤酒中高级醇的组成和含量，对提高啤酒的质量和风味有很重要的意义。

目前，国外对啤酒中高级醇含量的检测技术已经比较成熟[14－16]，随着消费者要求的提高，我国一些啤酒生产企业和研究部门开始注意啤酒中各组分的变化，对高级醇在啤酒中的作用有了初步的认识，认为啤酒中高级醇的适宜范围在 50 μg/mL～100 μg/mL[17－19]，过低影响口感与风味，过高易引起头晕。目前测定高级醇含量的方法有顶空进样－气质联用[20－21]、气相色谱－质谱联用[22－23]等，但由于设备昂贵，测样成本高，实验室仪器设备条件的限制，不能用来进行大批量检测。分光光度法也可测定啤酒中各种醇的含量，但是测定时间长、准确度不够、可能产生系统误差和选择性不高[24－25]。本试验拟采用顶空固相微萃取与气相色谱联用 （headspacesolid phase microextraction－gas chromatography，HS－SPME/GC）分析技术，采用实验室一般都有的气相色谱仪，并通过顶空固相微萃取的条件优化，尝试建立一种快速、准确、重复性好的检测啤酒中5种高级醇的方法，为其方法的可推广性进行验证。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

正丙醇（99.9%）、正丁醇（99.9%）、异丁醇（99.9%）、正戊醇（99.9%）、异戊醇（99.9%）标准品：美国Sigma公司。

6820气相色谱仪：美国Agilent公司，配有氢火焰离子化检测器；Oasis固相萃取头：美国Supelco公司。

1.2 方法

1.2.1 气相色谱条件

进样口温度250℃；升温程序：初始温度50℃，保持2 min，以5℃/min升至120℃，保持3 min，然后以10℃/min升至240℃，保持5 min，最后以15℃/min升至270℃，保持10 min；进样方式：分流比10∶1；载气：高纯氮气；空气：400 mL/min；氢气：30 mL/min；流速为0.8 mL/min。

1.2.2 萃取条件的优化

将萃取头插入气相色谱（gas chromatography，GC）进样口中，于250℃老化2h。称取2mL样品超声5 min赶去啤酒中的气泡后，置于10 mL顶空进样瓶瓶中，插入萃取头，于不同的萃取温度下顶空萃取一段时间，于250℃解析5.0 min。分别比较不同的萃取头、萃取温度以及萃取时间对样品中高级醇成分萃取效果的影响。

1.3 样品分析

将啤酒样品按气相色谱条件进行测定。采用保留时间及标准添加法定性，外标法定量。

2 结果与讨论

2.1 色谱柱的选择

本试验比较了 HP－5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）、TG－35MS（30 m×0.25 mm×0.5 μm）、TG－WAXMS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）这3款不同的色谱柱。结果发现TG－WAXMS色谱柱进行5种高级醇的分析色谱图效果较好，能够很好的分离各高级醇，并且具有良好的灵敏度，能够满足检测的需要。

2.2 色谱条件的优化

分别设置不同的柱初始温度（40、50、60、70℃）、分流比（5∶1、10∶1、20∶1、40∶1）以及载气流速（0.6、0.8、1.0、1.2 mL/min），考察其对被测5种组分分离度的影响，结果见图1。

图1 5种高级醇标准品的色谱图Fig.1 Chromatograms of 5 kinds of higher alcohol standard products

结果表明：当柱初始温度为60℃，分流比为10∶1，载气流速为0.8 mL/min时，5种高级醇的分离效果较好，具有较高的准确度。

2.3 固相微萃取头的选择

由于不同材质的固相微萃取头对啤酒中高级醇的萃取效果不同，因此不同类型的固相微萃取头的选择会影响到目标物的萃取效果。本试验选择并比较了4种较常见的固相微萃取头的萃取效果：85 μm聚丙烯酸酯 （polyacrylate，PA）、100 μm 聚二甲基硅氧烷（polydimethylsil－oxane，PDMS）、65 μm 聚二甲基硅氧烷（PDMS）/二乙烯苯（divinylbenzene，DVB）以及 50/30 μm 二乙烯苯（DVB）/聚乙二醇（Carbowax）/聚二甲基硅氧烷（PDMS），萃取效果的比较见图2。

图2 4种萃取头的萃取效果比较Fig.2 Extraction efficiencies of four solid phase microextraction fibers

由图2可知，不同类型的固相微萃取头对啤酒样品中5种高级醇萃取效果有很大影响。萃取头的萃取效果主要受萃取头涂层极性与表面积的影响。非极性涂层可有效萃取非极性化合物，极性涂层可有效萃取极性化合物。PA、PDMS对非极性化合物萃取效果较好，而Carbowax和DVB更适用于偏极性化合物的萃取。所以本实验选择的4种萃取头中，100 μm PDMS偏非极性的固相微萃取头对5种高级醇的萃取效果更 好，其次是 85 μm PA、50/30 μm DVB/Carbowax/PDMS 和 65 μm PDMS/DVB。因此选取 100 μm PDMS萃取头作为此次啤酒中高级醇萃取试验的萃取头。

2.4 萃取温度的选择

温度对固相微萃取头的萃取效果有双重影响，温度升高时，有利于高级醇的扩散，缩短了萃取的时间，但是温度的升高也会使目标物在萃取头的涂层中分配系数降低，导致吸附量减小，影响萃取头的灵敏度。在萃取时间为60 min时，分别比较了100 μm PDMS萃取头在40、50、60、70℃下对上述5种高级醇的萃取效果，结果见图3。

图3 萃取温度对高级醇组分吸附的影响Fig.3 Effect of extraction temperature on the adsorption of higher alcohol components

结果如图3所示，50℃条件下的萃取头对高级醇的吸附量最大，说明在此温度下的萃取效果最佳。萃取温度在40℃时，较低温度会导致目标物挥发的速度较慢或不完全挥发；而温度至60℃以上时，萃取头对高级醇的吸附量均有不同程度的减小，可能是由于目标物随着温度升高在萃取头涂层中吸附量下降所致。综合考虑，实验选择将50℃作为试验固相微萃取头的萃取温度。

2.5 萃取时间的选择

比较分析不同萃取的时间对5种高级醇萃取效果的影响，结果见图4。

图4 萃取时间对高级醇组分吸附的影响Fig.4 Effect of extraction time on the adsorption of higher alcohol components

结果如图4，随着萃取时间的增加，萃取头对高级醇的吸附量明显增加；当萃取时间超过40 min后，萃取头对高级醇的吸附量均有不同程度下。因此，选择40 min作为试验固相微萃取头的萃取时间。

2.6 啤酒中5种高级醇的定量分析

试验配制了浓度为 0.1、0.5、1.0、2.0、5.0 mg/mL 的系列5种高级醇的混合标准溶液上机进行检测。结果发现这5种高级醇的线性关系都符合标准，详细结果见表1。

表1 5种高级醇的出峰时间、方程曲线、关联系数、检出限、定量限Table 1 Retention time，standard curve，correlation coefficient，detection limit and quantitative limit of 5 kinds of higher alcohol

试验结果表明，5种高级醇在0.1 mg/mL～5.0 mg/mL内均具有良好的线性关系（r2＞0.999），并得到5种目标组分的检出限0.002 mg/mL～0.007 mg/mL，相对标准偏差范围为2.69%～4.22%。

2.7 加标回收与相对偏差试验

分别添加0.2、1.0、2.0 mg/mL等3个梯度浓度的高级醇混合溶液到啤酒样品中，测定结果见表2。

表2 回收率及方法的相对标准偏差Table 2 Recoveries and relative standard deviations（RSD）of the method

由表2可见，5种组分的3个水平的加标回收率为89.6%～95.9%，相对标准偏差（RSD）为2.4%～5.3%，表明本试验所建立的方法能够满足检测实际样品需要的灵敏度、精密度和准确度，可以用于啤酒样品中高级醇的分析检测。

2.8 样品中目标物的测定

按照上面确定的测定方法，对5种市售啤酒进行气相色谱分析外标法定量，结果见表3。

表3 啤酒样品测定结果Table 3 Determination of beers

从表3可以看出，5种啤酒成品高级醇含量均未超过其风味阈值，各组分含量适中，赋予了啤酒芳香的口味和酒体的醇厚感，图5为其中一款样品分析高级醇的气相色谱图。

图5 啤酒样品中高级醇的色谱图Fig.5 Chromatograms of higher alcohols in beer samples

3 结论

本文建立了HS－SPME/GC分析啤酒中5种高级醇的方法。针对样品中5种组分的极性性质，实验选择100 μm PDMS固相微萃取头，50℃顶空萃取40 min。5种高级醇的分离采用TG－WAXMS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）色谱柱，在 0.1 mg/mL～5.0 mg/mL 内均具有良好的线性关系（r2＞0.999），5种目标组分的检出限范围为0.002 mg/mL～0.007 mg/mL，加标回收率范围为89.6%～95.9%，相对标准偏差（RSD）为2.0%～4.3%。通过GC对4种啤酒样品中的高级醇含量检测，发现均未超过其风味阈值，各组分含量适中，赋予了啤酒芳香的口味和酒体的醇厚感。本试验建立的方法，可对啤酒中高级醇进行分析和测定，有助于提高检测实验室的分析此类样品的效率，在实验室的推广可行性较高，旨在为啤酒行业的质量改进提供试验依据。