分心木黄酮超声-微波协同提取及抗氧化性研究

（衡水学院 生命科学系，河北衡水053000）

核桃分心木简称分心木又名核桃隔膜，为胡桃科（Juglandaceae）胡桃属（Juglans L.）植物核桃的带骨质内果皮的种隔[1-2]。半圆形片状，表面呈棕色或浅棕色，略带光泽，具有补肾涩精、治疗多汗、尿频、遗尿、口腔溃疡、牙龈出血等多重功效[2]。相关研究表明[3-7]，核桃分心木中含有多糖、黄酮、生物碱、有机酸、甾类等多种化学成分，其中黄酮类物质含量较高。黄酮类物质有很多药理作用，如：抗氧化、抗肿瘤活性、抗病毒、免疫调节、抗心脑血管病等功效[8-11]，在食品、保健品、医药等方面应用十分普遍。

分心木数量广泛，且安全无毒。以前经常被人们当做垃圾丢弃，或当作燃料使用，这既浪费了资源，也污染了环境。为开发分心木资源，本试验采用超声-微波协同提取法对核桃分心木中黄酮类物质进行提取。超声波能通过机械效应引起组织细胞内物质运动，并有利于物质穿透细胞膜释放出来；同时超声波的热效应也能够减少提取时间。微波辐射可以使物质的极性分子急速振动，进而由内而外充分产生热量[12-13]。超声微波协同提取操作简单、速度快、提取物结构未被破坏、提取率高，有着突出的优势。本研究通过对分心木中的黄酮成分进行提取并研究其体外抗氧化活性[14-15]，从而为探索分心木黄酮药物及功能性食品开发奠定了基础，并为分心木的综合利用提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

核桃分心木：河北养元智汇饮品股份有限公司。

芦丁标准品：国家生物制品检定所；乙醇、Al（NO3）3、NaNO2、NaOH、VC、石油醚、乙酸乙酯、铁氰化钾、磷酸盐缓冲液、三氯乙酸、三氯化铁、DPPH、Tris-HCL、邻苯三酚、HCl、邻二氮菲、PBS、FeSO4、H2O2均为分析纯试剂：衡水瑞丰化玻仪器有限公司。

1.2 仪器与设备

XH-300A型微波超声波组合合成/萃取仪：北京祥鹄科技发展有限公司；TU-1901紫外-可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；JA5003N电子分析天平：上海精密科学仪器有限公司；F123602微量可调单道移液器：上海艾研生物科技有限公司；RE-52CS旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；KDC-12离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 分心木黄酮提取工艺流程

分心木→清洗→烘干→粉碎→过筛→超声-微波协同提取→过滤→滤液浓缩→纯化（石油醚洗涤，乙酸乙酯萃取）→冻干→分心木黄酮

1.3.2 标准曲线的绘制

精确称取芦丁标准品10.0 mg，用30%的乙醇溶液定容于100 mL容量瓶，摇匀后作为标准溶液备用。准确移取芦丁标准品溶液 0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于7个10 mL容量瓶中，按1.3.3的方法在510 nm测定黄酮的吸光度。以吸光度值（A）为纵坐标，芦丁溶液浓度（C）为横坐标，绘制芦丁溶液的标准曲线。

1.3.3 黄酮含量的测定方法

采用NaNO2-Al（NO3）3显色法，样品溶液加入质量浓度5%NaNO20.3 mL，混匀静置6 min，加入质量浓度10%Al（NO3）30.3 mL，静置6 min，加入质量浓度4%NaOH溶液4 mL，用体积分数30%乙醇定容，静置15 min后，在510 nm测定黄酮的吸光度。根据标准曲线计算黄酮含量。

1.3.4 分心木黄酮提取工艺优化试验

1.3.4.1 单因素试验

1）乙醇浓度对分心木黄酮得率的影响

准确称取1.00g分心木样品，分别加体积分数30%、40%、50%、60%、70%的乙醇25 mL，设置超声功率250 W、微波功率250 W、温度60℃进行提取10 min。

2）料液比对分心木黄酮得率的影响

准确称取1.00g分心木样品，依次按照料液比1∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30、1 ∶35（g/mL）的顺序加入 50%乙醇后，设置超声功率250 W、微波功率250 W、温度60℃进行提取10 min。

3）超声功率对分心木黄酮得率的影响

准确称取1.00 g分心木样品，按照料液比1∶25（g/mL）加入50%乙醇，依次设置超声功率为150、200、250、300、350 W，微波功率250 W、温度60℃进行提取10 min。

4）微波功率对分心木黄酮得率的影响

准确称取1.00 g分心木样品，按照料液比1∶25（g/mL）加入50%乙醇，超声功率250W，依次设置微波功率为 50、100、150、200、250 W，60 ℃下进行提取10 min。

5）提取温度对分心木黄酮得率的影响

准确称取1.00 g分心木样品，按照料液比1∶25（g/mL）加入50%乙醇，超声功率250 W，微波功率为150 W，分别在 40、45、50、55、60 ℃提取 10 min。

6）提取时间对分心木黄酮得率的影响

准确称取1.00 g分心木样品，按照料液比1∶25（g/mL）加入50%乙醇，超声功率250 W，微波功率为150 W，温度 50 ℃条件下分别提取 6、8、10、12、14 min。

1.3.4.2 黄酮得率的计算方法

式中：C为提取液中分心木黄酮的含量，g/mL；V为提取液体积，mL；M为分心木质量，g。

1.3.4.3 响应面分析

采用Design Expert 8.0.6软件设计响应面试验。根据Box-Behnken的中心组合试验设计原理，从单因素试验中选取对提取结果影响比较大的4个因素：料液比、超声功率、提取温度、提取时间为自变量，黄酮得率为响应值，共计29个试验点进行组合试验[16-20]。因素与水平见表1。

表1 因素与水平表Table 1 Response surface experimental factors and levels

1.3.5 分心木黄酮体外抗氧化活性试验

1.3.5.1 分心木黄酮对·OH的清除作用

试管中加入1 mL0.75 mol/L邻二氮菲，2 mL pH=7.45 PBS溶液、1 mL 蒸馏水、1 mL 0.75 mmol/L FeSO4溶液，1 mL 0.01%H2O2，充分混匀后于37℃下恒温水浴1 h。536 nm处测定其吸光度Ap；用1 mL水代替H2O2，测定其吸光度Ab；用1 mL样液代替1 mL水，测定其吸光度As[21]。以VC作对照。

1.3.5.2 分心木黄酮对DPPH·的清除作用

不同浓度的黄酮样液与DPPH溶液等体积混合，30 min后用无水乙醇作参比，在517 nm处测定其吸光度A1，测定不同浓度的样液与无水乙醇等体积混合液的吸光度A2；DPPH溶液与无水乙醇等体积混合液的吸光度A0，取3次平行试验结果根据下列公式计算对DPPH·的清除率[21－22]。以 VC作对照。

1.3.5.3 分心木黄酮对O2－·的清除作用

取 5 mL 0.05 mol/L，pH=8.2的 Tris－HCL 缓冲液25℃水浴预热20 min，分别加入1 mL样液，0.5 mL 25 mmol/L的邻苯三酚，混匀后25℃水浴准确反应4 min，立即加入2滴8 mol/L HCl终止反应。299 nm处测定吸光度A1，空白对照组的吸光度A0。将邻苯三酚溶液用0.5 mL蒸馏水代替，得到吸光度A2。取3次平行试验结果计算对超氧阴离子自由基的清除率。以VC作对照[23]。

1.3.5.4 总还原力的测定

1.0 mL样液加入2.5 mL的1%铁氰化钾溶液和2.5 mL的0.22 mol/L磷酸盐缓冲液，混合均匀后于50℃水浴中反应30 min，迅速冷却加入10%三氯乙酸2.5 mL，在4 000 r/min下离心10 min。最后取2.5 mL上清液，加2.5 mL蒸馏水和2.5 mL 0.1%三氯化铁溶液，混匀后静置10 min测定700 nm处的吸光度值[24]。以VC作对照。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的确立

按检测方法，测出芦丁标准品各浓度下的吸光度值，作出芦丁标准曲线，结果见图1。

图1 芦丁的标准曲线Fig.1 Standard curve of rutin

由标准曲线结果，得到其回归方程：A=10.682C－0.0011，R2=0.999 9，芦丁标准溶液在0.005 mg/mL～0.05 mg/mL的范围中，呈良好的线性关系。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 乙醇浓度的确定

乙醇浓度对分心木黄酮得率的影响见图2。

图2 乙醇浓度对黄酮提取得率的影响Fig.2 Effect of different ethanol concentration on yield of flavonoid

由图2可知，随乙醇浓度的增加，黄酮的溶解度也随之增加。在乙醇浓度50%的条件下，所提取的分心木中黄酮得率达到4.94%。乙醇浓度超过50%之后，黄酮得率下降。黄酮一般难溶或不溶于水，易溶于乙醇等有机溶剂。所以一开始随乙醇浓度增大得率增高。但乙醇浓度过高时，样品溶液沸点降低，且醇溶性杂质开始溶出，导致黄酮得率下降。由此可知，50%乙醇对黄酮的溶解性相对最好。

2.2.2 料液比的确定

料液比对分心木黄酮得率的影响见图3。

由图3可知，随料液比的增多，黄酮的溶解度也随之增加，即黄酮物质的得率增加。在料液比1∶25（g/mL）处，所提取的分心木中黄酮得率达4.98%。继续增大料液比后，黄酮物质得率增加不明显。且继续增大溶剂量既浪费溶剂又不易回收，所以料液比1∶25（g/mL）为宜。

图3 料液比对黄酮提取率的影响Fig.3 Effect of different rate of solid to solution on yield of flavonoid

2.2.3 超声功率的确定

超声功率对分心木黄酮得率的影响见图4。

图4 超声功率对黄酮提取率的影响Fig.4 Effect of different ultrasonic power to solution on yield of flavonoid

由图4可知，随着超声功率的增大，黄酮物质的得率也相应增加。在超声波功率达到250 W时，所提取的分心木中黄酮得率为5.01%。继续增大超声功率，黄酮物质提取率有轻微的降低。可能由于超声波功率的增大导致了黄酮的结构被破坏，所以超声功率以250 W为宜。

2.2.4 微波功率的确定

试验过程中发现，微波在本试验中只起到快速升温的作用，达到指定提取温度后，微波功率会迅速下降至可维持预定温度的功率，且数值非常小。提高微波功率有助于快速达到预定提取温度，节省了时间；但是微波功率过高又会引起温度升高过快导致超过预定温度导致试验出现误差。最终确定最佳微波功率为150 W，在该功率下即能够保证快速升至提取温度又能够维持预定温度。

2.2.5 提取温度的确定

温度对分心木黄酮得率的影响见图5。

分心木中黄酮物质的得率随着温度升高而增加，在50℃时，所提取的分心木中黄酮得率达5.09%。继续升高提取温度，黄酮物质提取率逐渐减小。可能是因为温度过高会使黄酮类化合物的结构被破坏，也可能是由于温度过高会溶出其它杂质，使得黄酮物质提取率降低。所以提取温度以50℃为宜。

图5 温度对黄酮提取率的影响Fig.5 Effect of different temperature on yield of flavonoid

2.2.6 提取时间的确定提取时间对分心木黄酮得率的影响见图6。

图6 时间对黄酮提取得率的影响Fig.6 Effect of different time on yield of flavonoid

由图6可知，在6 min～8 min内分心木中黄酮物质的得率随着时间的增加而增大，在8 min黄酮提取率达到最高值5.16%。时间继续增加黄酮得率变化不大并有减少可能是因为时间太长，会使黄酮类化合物的结构遭到破坏，也可能是由于长时间提取会使分心木粉末溶出其它杂质，使得黄酮物质提取率降低。所以为了保证黄酮物质的提取率以及减小提取周期，以8 min为宜。

2.3 响应面试验结果

2.3.1 试验结果

根据表1设定的水平和因素，共设29个试验点，其中24个为析因点，5个为零点。得到各个试验条件的黄酮得率，试验结果见表2、表3。

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Response surface experimental design and result

续表2 响应面试验设计及结果Continue table 2 Response surface experimental design and result

表3 回归模型的方差分析Table 3 The analysis of varianceof regression model

由软件分析得到回归方程为：Y=5.13+0.032A+0.069B+0.17C+0.11D-0.015AB+0.060AC-0.038AD-0.040BC+0.027BD-0.040CD-0.17A2-0.13B2-0.25C2-0.19D2，其中Y为核桃分心木黄酮含量的预测值。该模型的预测复相关系数R2=0.917 1，矫正系数Adj R2=0.969 2，说明试验的实际值和预测值拟合度比较好。

由表3可以看出，P<0.000 1，说明该模型极其显著，在统计学上是有意义的。失拟项P=0.094 0>0.05，说明不显著，即选择的模型对该试验的拟合度良好。A、B、C、D 4个因素所模拟的一次项都小于0.05，说明因变量和所选自变量之间的线性关系显著，该回归方程能代替试验真实点分析试验结果。模拟的二次项P都小于0.01，表明A、B、C、D 4个因素对分心木黄酮的提取率都达到极其显著的水平，交互项AC、BC、CD的P值小于0.05，达到显著水平，由此可知，料液比与提取温度、超声功率与提取温度、提取温度与提取时间这些因素之间都存在一定的交互作用，并且它们之间的交互作用会对分心木中的黄酮的提取率产生显著的影响。

2.3.2 响应面交互作用分析

通过Design-Expert 8.0.6软件，将AC、BC、CD交互进行分析比较，做出响应面曲线图，见图7。

图7 各个因子交互作用的响应面图Fig.7 The response surface of interaction between every two factors

由响应面三维图7可知，当各因素在一定范围内增大时，对应的响应值也增大；但当响应值达到最高点，各因素的值继续增大时，其响应值却不断减小。等高线图的中心点在3D图上的投影即最高点，表明该点的提取率最高。图7中每个响应曲面都开口向下，呈现凸面形状。

2.3.3 优化与验证试验

依据以上响应面试验模型和结果分析，得出最佳提取条件下的分心木中黄酮的提取率为5.19%，料液比 1∶25.6（g/mL），超声功率 261.8 W，提取温度 51.6℃，提取时间8.5 min。在此最佳条件下，将平行验证试验重复进行3次，可得分心木黄酮的提取率的平均值5.17%。实际所测得的提取率的平均值和预测值减少0.016%，表明该模型的可靠性较高，并且提取工艺的重复性良好。

2.4 分心木中黄酮体外抗氧化活性

分心木中黄酮体外抗氧化活性见图8。

图8 分心木黄酮的还原力及·OH、O2-·、DPPH·清除率Fig.8 Reducing power and hydroxyl，superoxide anion and DPPH radical scavenging activities of Diaphragma juglandis fructus flavonoids

根据图8能够看出，分心木黄酮对·OH、O2-·、DPPH·均能够起到清除作用，并且在试验浓度范围内，对自由基的清除能力呈现量效关系。当分心木黄酮浓度为2mg/mL时，对·OH和O2-·的最大清除率分别为66.2%、36.9%，而对DPPH·的清除率在浓度为0.07 mg/mL时即达到70.2%。在试验的浓度范围内，分心木黄酮和VC的还原力均随着浓度的增大而增大，线性关系较好，其中2 mg/mL的分心木黄酮的还原能力与0.65 mg/mL的VC几乎一致。可见分心木黄酮体外抗氧化活性较好。

3 结论

本试验采用响应面法优化分心木黄酮的提取工艺条件，并对其体外抗氧化活性进行研究。最优提取条件条件为：乙醇浓度50%，料液比1∶25.6（g/mL），超声功率261.8 W，微波功率150 W，提取温度51.6℃，提取时间8.5 min。分心木总黄酮得率为5.17%。分心木黄酮对·OH、O2-·、DPPH·均能够起到清除作用，当分心木黄酮浓度为2 mg/mL时，对·OH和O2-·的最大清除率分别为66.2%、36.9%，而对DPPH·的清除率在浓度为0.07 mg/mL时即达到70.2%，并且其还原能力强，能够说明其体外抗氧化活性较强。

采用超声微波协同提取法提取分心木中的黄酮类物质产率高，方法简单易行，提取率较好，产物具有较强的体外抗氧化活性。