外阴阴道假丝酵母菌病病原菌菌种分布及耐药性分析

2018-09-10 12:35华丽燕欧阳凯麦荣嘉
现代医院 2018年7期
关键词:假丝氟康唑念珠菌

曾 文 华丽燕 欧阳凯 麦荣嘉

假丝酵母菌(candida)俗称念珠菌,是人体皮肤黏膜的一种条件致病真菌,寄居于皮肤、口腔、胃肠道、阴道等部位,表现为急性、亚急性或慢性炎症,大多为继发性感染。因其可产生假菌丝而被称为假丝酵母菌。本菌属有81种,其中10种对人有致病性[1]。其中本院主要以白假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、克柔假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌等常见。阴道假丝酵母菌病主要病原菌是假丝酵母菌,常与外阴病变同时存在,故又称外阴 阴道假丝酵母菌病(Vulvovaginal Candidiasis VVC),是一种常反复发作的机会性真菌感染[2]。外阴阴道假丝酵母菌病(vulvovaginal candidiasis, VVC)是育龄妇女常见的阴道黏膜的真菌感染性疾病,是妇科最常见疾病之一。其主要症状为外阴部瘙痒不适、阴道烧灼感、部分患者阴道内分泌物异常增多,呈豆渣或凝乳状表现,伴尿频、尿痛、性交痛[3]。据统计,有75%以上的育龄妇女一生中至少有一次既往感染史,且有40%~50%的患者有复发史,有5%~8%的患者会发展成复发性外阴阴道假丝酵母菌病(Recurrent vulvovaginal candidiasis, RVVC)[4]。随着近年来抗生素滥用、不合理用药和免疫抑制剂等药物在临床上的广泛使用,VVC的发生率呈逐渐上升的趋势,且易反复发作难以根治,严重干扰了妇女的日常生活以及身心健康。因此,正确了解女性外阴阴道假丝酵母菌病病原菌的分布、菌群鉴定及其耐药特点,对临床的诊疗及用药起到非常大的作用。

1 研究对象和方法

1.1 研究对象

选取2017年1月1日-2017年12月31日广东省妇幼保健院越秀院区经妇科门诊拟诊为外阴阴道假丝酵母菌病的患者,其纳入标准包括:①症状:具有阴道假丝酵母菌的典型反应症状如外阴瘙痒、灼痛、性交痛,异味明显,阴道分泌物增多等;②体征:外阴红斑、水肿,多伴抓痕或皮肤皲裂,阴道黏膜潮红,阴道内可见白色黏稠呈乳胶或豆渣样分泌物;③实验室检查:阴道分泌物镜检发现假菌丝和(或)真菌孢子的患者。共307例,年龄在18~50岁之间。由临床医生采集其阴道分泌物标本,包括阴道分泌物涂片检查及含有阴道分泌物的拭子。

1.2 主要试剂

结晶紫快速染液、科玛嘉(CHROMagar)显色平板、葡萄糖、蛋白胨粉(OXIOD)、酵母粉(OXIOD)、琼脂(OXIOD)、ATB Fungus 3 酵母样真菌药敏试剂盒(微量稀释法)。

1.3 主要仪器

全自动细菌鉴定及药敏分析系统(梅里埃,型号:VITEK2 Compact)、2HFsafe型ClassⅡ级生物安全柜、电子分析天平、 LRH-250A型细菌生化培养箱、漩涡振荡器、麦氏浊度仪。

1.4 质控菌株

白假丝酵母菌ATCC10231,购自广东省微生物研究所。

2 方法

2.1 标本采集

选取经本院妇科门诊拟诊为外阴阴道假丝酵母菌病的307例患者的阴道分泌物,送检标本为阴道分泌物涂片以及阴道分泌物拭子。

2.2 阴道分泌物染色镜检及初步培养

将送检标本中的阴道分泌物涂片采用结晶紫染液快速染色后镜下观察,若发现菌丝或孢子则作为阳性标本。同时,将阳性标本的棉拭子接种入灭菌YPD液体培养基中(2 ml/每管),置35 ℃培养24~48小时,培养至浑浊。

2.3 初步鉴定

将YPD液体培养基中的浑浊的菌液接种至念珠菌显色平板内,置35 ℃培养24~48小时,判读结果。科玛嘉(CHROMagar)显色平板上翠绿色为白色念珠菌,灰蓝色为热带念珠菌,粉红色粗糙菌落为克柔念珠菌,紫红色为光滑念珠菌;如出现肉眼不能判别假丝酵母菌菌株,分纯后由梅里埃VITEK2 Compact全自动细菌鉴定及药敏分析系统完成待测真菌的鉴定。

2.4 药敏试验

按照ATB Fungus 3酵母样真菌药敏试验试剂盒的操作说明,挑取分纯培养的单个菌落,进行药敏试验(微量稀释法)。念珠菌属需置35 ℃培养24±2小时后判读结果。

3 结果

3.1 镜检结果

经结晶紫染色后镜检,共307例患者阴道分泌物显微镜检查可见到真菌孢子和(或)假菌丝,判断为镜检阳性标本。

3.2 液体培养基培养结果

307例标本均为镜检阳性标本(镜下观察到真菌孢子和、或假菌丝),307例标本中YPD液体培养基的培养出浑浊菌液的标本为277例,阳性率为90.23%。

3.3 固体培养基培养结果

将YPD液体培养基中的浑浊的菌液接种至念珠菌显色平板内,置35℃培养24~48小时后,念珠菌在科玛嘉显色平板中的结果,如图1所示:

图1 念珠菌在科玛嘉显色平板中生长,A:白色假丝酵母菌;B:光滑假丝酵母菌;C:克柔假丝酵母菌;D:近平滑假丝酵母菌;E:热带假丝酵母菌

3.4 277例阴道假丝酵母菌病病原菌YPD液体培养基阳性标本鉴定

结果如表1所示。

表1 科玛嘉显色平板的鉴定结果 (n)

3.5 药敏试验结果

对检出的277株阴道假丝酵母菌的药敏结果中,可以看出阴道白色假丝酵母菌对5-氟胞嘧啶和两性霉素B的敏感率较高,分别为84.18、100%,即阴道假丝酵母菌对5-氟胞嘧啶和两性霉素B的耐药率最低。阴道白色假丝酵母菌对氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑等唑类抗真菌药物的敏感率较低,分别为69.49%、66.1%、72.88%,即阴道白假丝酵母菌对氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑的耐药率较高。而在非白假丝酵母菌中,光滑假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌、热带假丝酵母菌和克柔假丝酵母菌对5-氟胞嘧啶和两性霉素B的敏感率均为100%,即5-氟胞嘧啶和两性霉素B的敏感率仍是最高。而在光滑假丝酵母菌和近平滑假丝酵母菌对伊曲康唑的耐药明显,敏感率分别有30%、46.42%。详见表2。

表2 277株假丝酵母菌属对五种抗真菌药物的敏感率 n(%)

注:克柔念珠菌对氟康唑天然耐药,应报耐药

4 讨论

阴道炎是临床较为常见的妇科疾病之一,临床表现以外阴瘙痒、灼痛、分泌物增多,异味明显及性交痛等症状为主。较常见的病症主要为外阴阴道假丝酵母菌病、细菌性阴道炎、滴虫性阴道炎等。据流行病学资料显示,有3/4 的育龄期妇女至少有1次VVC发病史,而有10.23%的VVC患者由于反复发作转化为RVVC,即VVC妇女经治疗后,临床症状和体征消失,但真菌学检查阴性后出现假丝酵母菌感染症状,且一年内反复发作4次及以上[5]。除去妊娠状态、合并糖尿病、长期使用广谱抗生素以及免疫抑制剂等可能存在的诱发因素外,目前大部分复发性外阴阴道假丝酵母菌病患者的复发机制尚不明确,临床上对于本病的治疗方案尚不统一[6]。随着近些年来广谱抗生素和免疫抑制剂等药物在临床上的广泛使用,VVC的发生率呈逐渐上升的趋势[7]。其原因一,病原菌种的变迁。过去一直认为VVC主要病原菌为白色假丝酵母菌,占疾病的80%~90%,同时白色假丝酵母菌对 5-氟胞嘧啶、两性霉素 B、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑的敏感性均较好,因此临床治疗初诊时缺乏菌属鉴别。近年来,杨淑华等人的研究发现VVC患者中非白色念珠菌所占的比例有上升趋势8]。氟康唑和伊曲康唑对除白色假丝酵母菌外的其他假丝酵母菌的敏感率较低,尤其是克柔假丝酵母菌对氟康唑天然耐药;这要求我们在实际工作中必须加强假丝酵母菌属的培养、 鉴定和药敏试验的工作。其二,不规范性用药、错误性用药以及滥用抗真菌药导致耐药菌株的出现。白色假丝酵母菌对唑类药物的耐药情况愈发严重,给临床治疗带来了严重困难。当前RVVC的临床治疗原则主要基于积极去除诱因和规范化应用抗真菌药物,但并未有成熟的方案[9]。本研究通过收集妇科门诊拟诊为外阴阴道假丝酵母菌病患者的阴道分泌物镜检阳性标本307例进行真菌分离培养,培养得到的浑浊菌液的标本为277例,阳性率为90.23%;对于其余30例镜检阳性而液体培养阴性标本,首先考虑假丝酵母菌属于机会致病菌,可定植在阴道里,显微镜下观察可见真菌孢子和(或)菌丝即为阳性标本,但并不能确定是否为真正的致病菌,应结合临床症状及实验室检查做出相应的诊断;其次,镜检存在一定的人为误差,镜检阳性的判断可能存在一定的误差;最后,考虑真菌在空气中分布广泛,临床医生在取阴道分泌物或者在标本的运输、检测过程中,有可能存在一定的污染可能。在常规检查中,显微镜检查仍是最为简单、经济、快捷而且准确的检测手段。然而,镜下检查欠缺区分假丝酵母菌的种类的能力,导致临床诊断治疗缺乏依据,临床医生根据经验用药,尤其对非白色念珠菌所用的抗真菌药物缺乏针对性,进一步使抗真菌药物的耐药率的不断增高,加上当前医疗环境下不合理的抗生素使用,破坏阴道内正常的微生态环境,导致外阴阴道假丝酵母菌病(RVVC)的反复发作。所以,了解病原菌的菌种分布及耐药性分析,对指导临床用药有极大意义。目前,临床上普遍认为假丝酵母菌是引起阴道炎反复发作的主要原因。国内有学者进行阴道炎反复发作的病因分析时得出结论:反复发作、单纯感染的阴道炎患者中,假丝酵母菌性阴道炎的比例为33.1%,居其病因构成的首位。在本研究中,共培养出277例病原菌,其中白色假丝酵母菌177例(63.90%),光滑假丝酵母菌62例(22.38%),近平滑假丝酵母菌28例(10.11%),克柔假丝酵母菌6例(2.17%),热带假丝酵母菌4例(1.44%),结果符合白色假丝酵母菌是外阴阴道假丝酵母菌病的主要致病菌这一结论[10];虽然白色假丝酵母菌的比例仍旧最高(构成比为63.9%),然而VVC患者非白色假丝酵母菌感染率的上升已成为不可忽视的事实。本研究结果显示非白色假丝酵母菌的比例有明显的增大,构成比达到36.1%。非白色假丝酵母菌构成比的升高的主要原因与临床在诊断外阴阴道假丝酵母菌病时,未进一步培养鉴定至具体菌种和药敏试验密切相关。目前,氟康唑对临床上治疗阴道假丝酵母菌的首选药物[10]。然而,克柔假丝酵母菌对氟康唑天然耐药,光滑假丝酵母菌与近平滑假丝酵母菌对氟康唑敏感性降低都给临床治疗带来挑战;在临床经验性用药或者患者不规范用药治疗VVC时,阴道的微生态被破坏;白色假丝酵母菌被抑制,而非白假丝酵母菌未被抑制,压力筛选下,阴道内假丝酵母菌属发生变迁,导致VVC中非白色假丝酵母菌的比例上升[11-12]。因此,增加假丝酵母菌的菌种鉴别的检测手段,能有效的预防VVC的发病和提高RVVC的治疗效果。VVC发病率有上升的趋势,主要因为其阴道内坏境被破坏,导致菌群失调,正常的乳酸杆菌活性和质量均下降,一些条件致病菌如假丝酵母菌则快速生长导致VVC的发生,尤其对于长期使用广谱抗菌药物、糖皮质激素、免疫抑制剂的患者和妊娠妇女更易感染。基于VVC的流行现况,临床医师应根据假丝酵母菌的菌种鉴定以及其药敏试验结果,指导临床选择合适的抗真菌药物以及药物用量,能有效避免无效用药或降低假丝酵母菌耐药菌株产生的风险。目前,唑类抗真菌药物是临床上主要的抗真菌感染药物—以氟康唑、伊曲康唑为代表的第3代抗真菌药是治疗真菌感染的首选。然而,国内外学者研究发现白假丝酵母菌对氟康唑的耐药问题日益显著,对于非白假丝酵母菌的耐药情况也有相关报道[11]。在本研究中,白假丝酵母菌属对抗菌药物的敏感率以两性霉素B最高,达100%,其次为5-氟胞嘧啶为84.18%,伏立康唑为72.88%,而对氟康唑和伊曲康唑敏感率最低为 69.49%和66.1%。本研究表明,以上5种抗菌药对于治疗白色假丝酵母菌感染仍是有效的抗菌药物,说明目前临床使用这些抗真菌药物有较好疗效。临床药物治疗中,由于两性霉素B、5-氟胞嘧啶的药物毒性较大,尤其孕妇禁用,不适合临床治疗的首选,故目前治疗外阴阴道假丝酵母菌病主要以第3代抗真菌药(氟康唑、伊曲康唑)为主,而体外敏感实验提示这两种唑类常用药敏感率不高,且伊曲康唑的耐药情况在光滑假丝酵母菌和近平滑假丝酵母菌中比较明显,其敏感率仅为30%和46.42%,可能与近年来临床广泛应用唑类药物诱导耐药菌株的产生有关。加之非白假丝酵母菌致病比例有逐年上升趋势,并出现对临床常用抗真菌药物的耐药现象,临床治疗将更复杂和困难,而VVC患者病情会反复。其中克柔假丝酵母菌对氟康唑天然耐药,更需要进一步将真菌鉴定到具体菌种并进行对应的药敏试验,有针对性地使用抗真菌药物才能有效治疗克柔假丝酵母菌引起的VVC。结果显示5-氟胞嘧啶和两性霉素B对非假丝酵母菌属敏感性均很高,耐药性最低,但由于对人体毒性作用大,临床使用仍受到一定限制。

综合比较各菌种间对药敏试验中所用五种抗真菌药物的敏感程度,不同菌种对于不同抗真菌药物的敏感率存在明显差异,因而我们在实际临床工作中必须加强外阴阴道假丝酵母菌病的菌种鉴定以及其体外药敏试验,根据菌种鉴定结果及药敏结果选择合适抗真菌药物进行规范治疗,并且强调足量、足疗程、必要时可联合用药,并且重视巩固治疗及根据医嘱及时随访,避免盲目使用抗真菌药物,减少临床耐药菌株的出现。

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