3种作物初期生长对全氟辛烷磺酸盐和全氟辛酸的响应及富集特征

杨鸿波， 廖朝选， 赵亚洲， 谢 勋， 谭 红

(1.北京化工大学，北京 100029； 2.贵州省分析测试研究院，贵州贵阳 550002)

全氟化合物具有极高的化学稳定性和良好的疏水疏油性，在民用和工业产品生产中被广泛应用[1-2]。随着经济的快速发展，大量的全氟化合物被暴露于环境中，通过呼吸和摄食被生物体吸收，在生物体内蓄积，由于其持久性强，已成为当前环境中最难降解的污染物之一[3-4]。全氟辛烷磺酸盐(perfluorooctane sulphonate，简称PFOS)和全氟辛酸(perfluorooctanoic acid，简称PFOA)是被普遍检出的全氟化合物[5-6]，具有高生物蓄积性，同时对生物体具有生殖毒性、免疫毒性、神经内分泌毒性、肝脏毒性、发育神经毒性等[7-8]，且由其引起的神经毒性具有潜伏性，往往在个体成熟后才显现出来[9]；其中PFOA还可影响胚胎发育、生物行为，并可造成DNA损伤[10]。PFOS和PFOA的大量生产与广泛利用，使得在动、植物体内被广泛检出，其对环境产生了严重危害[11]；PFOS或PFOA通过人类摄食蔬菜、禽蛋、肉类等食物而间接进入人体，正威胁着人类的健康。了解PFOS和PFOA对植物的生长影响以及在体内的分布，可为植物中全氟化合物的污染阻控提供数据支持。

针对PFOS和PFOA对植物生长发育的影响，Stahl等在2009年率先系统研究春小麦、燕麦、马铃薯、玉米、多年生黑麦草等5种植物对土壤中PFOA和PFOS的生物利用性，结果发现，0.25～50.00 mg/kg范围内高浓度的PFOA和PFOS对植物的生长会产生影响，特别是对马铃薯而言，土壤中的PFOA和PFOS浓度就越高，植物中全氟化合物(perfluorinated compounds，简称PFCs)浓度就越高，且营养器官比储能器官更敏感[12]。吕振娥等通过研究小麦、大麦、白菜、白车轴草、绿豆等5种植物在短期内受PFOS的抑制作用发现，小麦根伸长的半效应浓度(median effect concentration，简称EC50)为352 mg/kg，最为敏感[13]。Qu等发现，低浓度的PFOS可以轻微刺激小麦幼苗的生长，诱导小麦幼苗中叶绿素和可溶性蛋白质的合成，而当PFOS浓度超过10 mg/L时可抑制根生长，影响根、叶生物量，并阻碍叶绿素的累积和可溶性蛋白质的合成[14]。由此可知，PFOA和PFOS可以被植物从土壤中吸收并对植物产生影响，但影响程度不同。

植物可以从土壤中吸收富集PFOS和PFOA，并由根部向茎叶部分迁移，且主要富集在植物的营养器官中[15]。通过研究小麦对PFCs的吸收动力学特性发现，小麦根部对PFOA的吸收速度远大于PFOS，在暴露100 h时，趋近于稳定，且根部的吸收大于茎的吸收，温度、盐度、pH值、受试物浓度对根部吸收2种全氟化合物均具有一定程度的影响[16-17]，总体来看，PFOS主要被根部吸收。Krippner等通过水培法研究3种全氟羧酸(perfluorocarboxylic acids，简称PFCAs)和7种全氟烷基磺酸(perfluoroalkylsulfonic acids，简称PFSAs)全氟化合物的碳链以及pH值对玉米富集全氟化合物的影响，结果发现，玉米对PFSAs类化合物吸收速率最快的是长链PFOS，短链PFCAs容易在茎叶中富集，长链PFCAs和PFOS主要富集在根部[18]。在真实环境中，Zhang等通过分析辽宁省大连市阔叶和针叶植物中10种PFCAs和4种PFSAs的分布发现，针叶对PFCAs和PFSAs的吸收均大于阔叶，叶片中PFCAs含量大于PFSAs，短链PFSAs含量高于长链等[19]。

当前，众多专家学者使用小麦进行了大量的吸收动力学研究，并对比研究了植物对不同碳链及不同基团全氟化合物的吸收作用，而对于相同碳链不同基团的PFOA、PFOS在单独和联合作用的研究较少；不同作物对PFOA、PFOS的吸收利用情况不同，目前针对油类作物大豆、油菜以及粮食作物水稻对全氟化合物富集作用的研究较少。我国土壤中的PFOS、PFOA含量大多在5 ng/g以内，最高值为62.45 ng/g[20-22]。低浓度的PFOS会轻微刺激根的生长和酶活性的提高，而当浓度增至 200 mg/kg 时，会抑制根的生长和酶活性的提高，且会提高渗透性。研究PFOS和PFOA对水稻、大豆、油菜的生长发育影响及在3种作物体内的分布特征，以期为全面评价全氟化合物对人类的潜在危害提供理论数据支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试种子 禾本科单子叶植物水稻(Oryzasativa)种子由四川省绿丹种业有限责任公司生产(批次：201512)；豆科双子叶植物大豆(Glycinemax)种子由江西省丰城市航城种业有限公司生产(批次：20160303)；十字花科双子叶植物油菜(BrassicacampestrisL.)种子由贵州农业科学研究院研制(批次：201609)。

试验前将作物种子在10%次氯酸钠消毒液中浸泡 10 min，然后把种子转移到培养皿中并用去离子水漂洗后浸泡，大豆种子浸泡20 min，油菜种子浸泡30 min，水稻种子浸泡1 h。

1.1.2 试验土壤 试验土壤为黄壤土，采集于贵州省植物园天然林内，未使用化肥并远离化学污染源，风干后过2 mm筛备用。土壤的pH值为5.90，有机质含量为2.92%，阳离子交换量为18.1 cmol/kg。

1.1.3 仪器与设备 人工气候培养箱(北京科伟永兴仪器有限公司制造)，箱内密布LED灯。

试验用花盆为一次性花盆，直径为18 cm，有效播种面积约为250 cm2，带储水盘。

液相色谱-质谱联用仪：Agilent LC-MS/MS，1290-6460 Agilent 1290 Infinity二元泵(G4220A)，Agilent 1290 Infinity高效自动进样器(G4226A)，Agilent 1290 Infinity系列柱温箱(G1316C)，Agilent6460三重四级杆电喷雾离子源(electron spray ionization，简称ESI)，MassHunter (B.08.00)工作站。N-EVAP-24氮吹仪(美国Organomation Associates，Inc.制造)。梅特勒-托利多电子天平，测量精度为0.000 1 g；Milli-Q超纯水仪(默克密理博公司制造)。

1.1.4 试剂与固相萃取柱 全氟辛烷磺酸钾盐(PFOS-K，CAS：2795-39-3，百灵威科技有限公司，纯度>98%)；全氟辛酸(PFOA，CAS：335-67-1，百灵威科技有限公司，纯度>98%)；甲醇(液相色谱-质谱联用级，Merck Drugs & Biotechnology)；丙酮[分析纯，重庆川东化工(集团)有限公司]；甲醇、氨水、甲酸、乙酸铵、异丙醇均为分析纯，均购自国药集团化学试剂有限公司。

CNWBOND WAX弱阴离子交换固相萃取柱(solid-phase extraction，简称SPE)(上海安普实验科技股份有限公司)，500 mg×6 mL。

1.2 试验方法

1.2.1 浓度设置 分别设置1.0、5.0、25.0 mg/kg PFOS组和PFOA组，2.0、10.0、50.0 mg/kg联和试验组(CPFOS∶CPFOA=1 ∶1)。

1.2.2 暴露试验土壤制备 准确称取0.287 0 g PFOS、0.287 1 g PFOA，分别置于25 mL容量瓶中，用丙酮溶解并稀释得到浓度均为11.25 mg/mL的PFOS、PFOA储备液。(1)PFOS试验组：分别取0.4、2.0、10.0 mL PFOS储备液加入到3份质量均为100 g的试验土壤中，搅拌混匀并挥干溶剂备用。另称取4.4 kg试验土壤，将制备的100 g加药土壤加入其中，趁干搅拌混匀，然后加入800 mL去离子水继续搅拌混匀，得到1.0、5.0、25.0 mg/kg PFOS暴露试验土壤，然后将各浓度土壤平均分为3份置于花盆中备用。(2)PFOA试验组：取样量与操作方法同PFOS试验组，且同样将制备得到的1.0、5.0、25.0 mg/kg的PFOA暴露试验土壤平均分为3份置于花盆中备用。(3)联和试验组(CPFOS∶CPFOA=1 ∶1)：分别依次取PFOS、PFOA储备液各0.4、2.0、10.0 mL 加入到3份质量均为100 g的试验土壤中，搅拌混匀并挥干溶剂备用。另称取4.4 kg试验土壤，将制备的100 g加药土壤加入其中，趁干搅拌混匀，然后加入800 mL去离子水继续搅拌混匀，得到2.0、10.0、50.0 mg/kg混合暴露试验土壤，然后将各浓度土壤平均分为3份置于花盆中备用。(4)对照组：取100 g试验土壤，加入20.0 mL丙酮，搅拌混匀并挥干溶剂备用。另称取4.4 kg试验土壤，将制备的100 g加丙酮的土壤加入其中，趁干搅拌混匀，然后加入800 mL去离子水继续搅拌混匀，得到对照组试验土壤，然后将该土壤平均分为3份置于花盆中备用。

1.2.3 暴露试验 参照GB/T 31270.19—2014《化学农药环境安全评价试验准则》“第19部分：非靶标植物影响试验”中300～1 000粒/m2的播种密度要求，结合种子大小与分析测试要求，每盆播种的种子数量为水稻20粒、大豆10粒、油菜25粒，种植密度分别约为800、400、1 000粒/m2。试验时将预处理后的水稻、大豆、油菜种子分别播种于各浓度系列及对照组的花盆中，然后置于培养箱中准备试验，并将储水盘蓄水以保证试验所需水分供应。培养箱的光—暗周期设置为16 h—8 h；光照时温度为(25±2) ℃，黑暗时温度为(22±2) ℃；在种子萌芽前，湿度保持在80%以上，种子萌芽后控制湿度在70%～85%之间。

试验开始后，记录种子的出苗情况，并在对照组种子半数萌芽后第14天，取出各盆试验植物，进行株高、生物量测定。

1.2.4 全氟化合物在植物体内的分布特征分析 将各植物根、茎、叶分离并分别剪碎制得的根、茎、叶样品。称取1.0 g样品，加20 mL甲醇振荡提取，经涡旋、离心处理使其上部澄清；然后取1 mL上清液，加入5 mL 2%甲酸水溶液，经涡旋处理后制备得试样初提取液。

取wax-SPE小柱，使用2 mL甲醇和1 mL去离子水分别活化，再使用2%甲酸水溶液平衡。然后将试样初提取液加入柱中，使用2 mL 2%甲酸水溶液淋洗，再用4 mL 3%氨化甲醇洗脱，经氮气吹干后，用甲醇和水(体积比为1 ∶1)混合液定容至1 mL，制备得试样提取液，然后用液相色谱-质谱联用仪测定。试验时分别使用茎、叶、根进行基质加标回收率试验，其回收率在88.9%～98.4%之间，样品的测定不进行回收率校正。

仪器及条件为色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18，2.1 mm×50 mm，1.8 μm；柱温为40 ℃；进样体积为2 μL；进样针冲洗 ∶端口清洗(异丙醇 ∶水体积比为1 ∶1)，2 s；流动相：A=5 mmol/L 乙酸铵水溶液，B=甲醇，流速为 0.20 mL/min。梯度洗脱程序：0～0.50 min，70.00% A+30.00% B；0.51 min，50.00% A+50.00% B；4.50 min，20.00% A+80.00% B；5.00 min，70.00% A+30.00% B，总运行时间6 min(平衡时间1 min)。质谱(mass spectrometry，简称MS)配置和条件：负离子模式；扫描模式：多反应监测(multiple reaction monitoring，简称MRM)，毛细管电压为 -3 500 V，喷嘴电压为-500 V，雾化器压力为0.31 MPa，干燥器温度为300 ℃，干燥器流速为6 L/min，鞘气温度为300 ℃，鞘气流速为10 L/min，电子倍增器电压为400 V，质谱MRM参数见表1。

表1 质谱仪参数

1.2.5 数据分析 PFOS和PFOA对作物出苗率、株高、生物量的影响采用SPSS 11.5软件进行统计和分析，以P<0.05作为显著性差异水平。

采用茎、叶、根对PFOS和PFOA的富集因子(root concentration factor，简称RCF)、传输因子(transfer factor，简称TF)进行作物体内的富集体征分析，并评价其对植物的潜在影响。采用色谱工作站MussHunter对数据进行采集和定量分析，采用Origin Pro 8.0对数据进行统计和绘图。根富集因子[9]的计算公式为

(1)

式中：C根为作物根中PFOS或PFOA浓度，mg/kg干基；C土壤为有机质归一化后土壤中PFOS或PFOA浓度，mg/kgoc干基。

传输因子可指示供试植物自根向茎、叶传输化合物的能力，其计算公式为

(2)

式中：C茎叶为作物茎、叶中PFOS、PFOA浓度，mg/kg干基；C根为作物根中PFOS、PFOA浓度，mg/kg干基。

2 结果与分析

2.1 PFOS、PFOA对3种植物出苗率、株高、生物量的影响

在各浓度的PFOS、PFOA暴露试验土壤以及PFOS和PFOA混合暴露试验土壤中，所有种子全部发芽；水稻株高约30 cm，生物量约0.055 g/株；大豆株高约21 cm，生物量约 0.53 g/株；油菜株高约3.4 cm，生物量约0.007 g/株，对照组与各处理组出苗率、株高、生物量差异较小。

2.2 PFOS、PFOA在3种植物植株根内的富集情况

由图1可知，水稻、大豆、油菜根中PFOS、PFOA浓度与土壤中供试物浓度均呈极显著的线性相关关系，且随土壤中供试物浓度的增大而增加。与Stahl等的结论[12]相似，即随着土壤中PFOS、PFOA浓度的增加，PFOS、PFOA向植物中转移的量也增加。

由表2、表3可知，PFOS在水稻、大豆、油菜根中的富集浓度分别为9.9～87.0、2.4～42.8、1.9～15.9 mg/kg，经有机质归一化后其富集因子分别为0.103～0.292、0.051～0.111、0.019～0.058，表明3种作物对PFOS的富集能力表现为水稻>大豆>油菜；水稻、大豆、油菜对PFOS的传输因子分别为 0.220～0.262、0.193～0.345、0.316～0.368，均小于1，表明3种植物均可自根向茎叶传输PFOS，根中浓度大于茎叶[11]。

PFOA在水稻、大豆、油菜根中的富集浓度分别为11.0～81.1，3.3～53.4，18.6～141.7 mg/kg，经有机质归一化后其富集因子分别为0.096～0.368、0.063～0.097、0.168～0.549，表明3种作物对PFOA的富集能力表现为油菜>水稻>大豆；水稻、大豆、油菜对PFOA的传输因子分别为 0.236～0.675、0.056～0.143、0.099～0.120，均小于1，表明3种植物均可自根向茎叶传输PFOA，根中浓度大于茎叶。

表2 3种植物对PFOS和PFOA的富集情况

表3 3种植物对PFOA、PFOS的RCF和TF

由图2可以看出，在PFOS、PFOA联和试验中，3种作物对PFOS、PFOA的富集量随供试物浓度增大而增加，与单独试验一致；由表2可知，水稻、大豆、油菜根中的富集浓度分别为23.8～189.9、6.7～146.2、26.4～151.7 mg/kg，茎叶中的富集浓度分别为5.1～56.5、3.0～91.0、12.3～45.2 mg/kg，PFOS、PFOA联合试验与单独试验的总富集量无明显差异。

3 讨论

当土壤中PFOS、PFOA浓度为1.0～25.0 mg/kg时，PFOS、PFOA对水稻、大豆、油菜的出苗率、株高、生物量均无明显影响，这与赵淑艳研究中PFAs对小麦的生物量无明显影响[15]一致。水稻和小麦、大豆、油菜分别所属的禾本科、豆科、十字花科农作物在我国种植范围最广、生产量最多，表明在当前土壤背景下，PFOS和PFOA不足以影响作物的生产。但在Zhou等的研究中，当PFOS的浓度升高至200 mg/L时，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，简称SOD)和过氧化物酶(peroxidase，简称POD)活性明显降低[23]，表明在高浓度PFOS条件下，小麦幼苗抗氧化防御系统可能会受到损害，PFOS和PFOA对作物的影响仍不可忽视。

植物中的PFOS、PFOA浓度与土壤中的PFOS、PFOA浓度呈线性相关关系，且随土壤中供试物浓度的增大而增加。在3种植物中，不管PFOS、PFOA是单独存在，还是等比例存在于土壤中时，在植物根部的富集量均高于在茎叶中的富集量。Wen等研究发现，较短链全氟磺酸(perfluorosulfonic acids，简称PFSAs)主要通过转移集中在茎叶中，而长链PFCAs如全氟辛酸(PFOA)、全氟壬酸(PFNA)、全氟癸酸(PFDA)、全氟辛烷磺酸己烷磺酸(PFHxS)、全氟辛烷磺酸(PFOS)，主要通过吸收集中在根部[24]，由于二者具有相同的碳链结构(C>4)，说明在由土壤转移到根部时，由土壤转移到根部时，土壤孔隙中的化合物经被动扩散被植物根吸收，再经过木质部的水相或韧皮部汁液的蒸腾作用转移到植物体内，起主要作用的是亲脂性结构端；从韧皮部汁液到茎叶的传输过程中，水溶性更强的有机物能更多地从根部传输到茎叶，PFOS和PFOA的亲水端不同，所以二者的TF不同。同时也有研究发现，植物根系中PFOS、PFOA的累积量与根系蛋白质含量呈显著正相关关系(P<0.05)，而与根系脂肪含量呈显著负相关关系(P<0.05)，表明蛋白质对根吸收PFOS、PFOA具有促进作用，脂质具有抑制作用；传输因子与茎叶和根中蛋白质含量比例呈正相关关系[25]，说明蛋白质和脂质对PFOS的积累和分布作用不同； 而在PFOA和PFOS联合作用时，未体现协同作用，只是浓度加和作用，即PFSAs在植物中的传输和富集作用机制会因为植物的不同而不同，同时受土壤中有机碳影响。进一步的机制还须要更深入的研究。