基于SRAP和ISSR标记的薄荷种质资源遗传多样性及亲缘关系分析

王少铭 侯颖辉 罗莉斯 冷家归 李德文

摘要：【目的】研究薄荷種质资源的遗传多样性及亲缘关系，为薄荷地方种质资源的收集、保护及材料创新提供参考。【方法】结合SRAP和ISSR标记对48份不同来源薄荷种质材料的DNA进行多态性扩增，并根据扩增图谱进行遗传多样性及聚类分析。【结果】利用筛选的20对SRAP和ISSR引物从48份薄荷种质材料分别扩增出187和183条条带，多态性比率分别为97.33%和97.27%。48份薄荷种质材料的平均Neis遗传多样性指数（H'）为0.1672，平均Shannons信息指数（I）为0.2762，说明供试薄荷种质材料的遗传多样性较丰富。聚类分析结果显示，48份薄荷种质材料可分为五大类，其中I类又可分为5个亚类，该聚类结果主要由品种差异决定，受地域影响较小;在遗传相似系数为0.76处可将33份贵州薄荷资源分为四大类。不同来源的薄荷群体遗传多样性排序为引进群体>贵州群体>重庆群体>云南群体，贵州群体与引进群体遗传距离最大，与云南群体和重庆群体遗传距离较小，说明贵州群体、云南群体和重庆群体亲缘关系较近。【结论】SRAP和ISSR标记对薄荷种质材料的多态性检出率较高。薄荷属种间具有丰富的遗传多样性，但种内遗传变异较小。贵州薄荷种质材料的遗传基础较引进材料狭窄，与云南和重庆的薄荷种质材料遗传背景较近。

关键词： 薄荷;SRAP;ISSR;遗传多样性;亲缘关系

中图分类号： S567.235.024                              文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）11-2148-07

Genetic diversity and genetic relationship of Mentha L. germplasm resources based on SRAP and ISSR markers

WANG Shao-ming， HOU Ying-hui， LUO Li-si， LENG Jia-gui， LI De-wen*

（Institute of Oil Crops， Guizhou Academy of Agricultural Sciences， Guiyang  550006， China）

Abstract：【Objective】This study was conducted to investigate the genetic diversity and genetic relationship of Mentha L. germplasm resources in order to provide reference for Mentha L. germplasm resources collection， protection and innovation. 【Method】The DNA of 48 samples of Mentha L. germplasm resource materials from different sources were conducted polymorphic amplification by SRAP and ISSR markers. Genetic diversity and cluster analysis were conducted on the basis of  amplification map. 【Result】A total of 187 and 183 bands were amplified respectively from 48 samples of Mentha L. germplasm resource materials by using 20 selected pairs of SRAP and ISSR primers. The polymorphic rates of SRAP and ISSR primers were respectively 97.33% and 97.27%. The average Neis genetic diversity index（H'） of 48 samples of Mentha L. germplasm resource materials was 0.1672 and the average Shannons information index（I） was 0.2762， indicating that the Mentha L. germplasm resource materials collected were relatively rich in genetic diversity. The result of cluster analysis indicated that 48 samples of Mentha L. germplasm resource materials could be divided into five categories， and category Ⅰ could be divided into five classes. The results of cluster analysis mainly depended on the difference of varieties and the influence of regional factor was small. Thirty-three  Mentha L. resources in Guizhou could be divided into four categories when genetic similarity coefficient was 0.76. Further studies showed that the genetic diversity level of different Mentha L. populations from different sources was manifested as introduced population>Guizhou population>Chongqing population>Yunnan population. The genetic distance between Guizhou population and introduced population was the largest while the genetic distances among Guizhou， Yunnan and Chongqing populations were small， indicating that the genetic relationships among Guizhou， Yunnan and Chongqing populations were close. 【Conclusion】The polymorphic detection rates of SRAP and ISSR molecular markers on Mentha L. germplasm resource materials are high. There is abundant genetic diversity among Mentha L. species，while the intra-species genetic variation is relatively small. The genetic basis of the Mentha L. germplasm resource materials in Guizhou is relatively narrow compared with the introduced germplasm resource materials. And the genetic background of Mentha L. germplasm resource materials in Guizhou is close to those in Yunnan and Chongqing.

Key words：  Mentha L.; SRAP; ISSR; genetic diversity; genetic relationship

0 引言

【研究意义】薄荷（Mentha haplocalyx Briq.）为唇形科（Labiatae）薄荷属（Mentha L.）植物，是世界上主要的香料植物，也是一种常用的中药材（房海灵等，2010）。薄荷的用途广泛，从其茎和叶中提取的薄荷油、椒样薄荷油、留兰香油及经加工得到的薄荷脑等已广泛应用于医药、食品、化妆品、香料及烟草等领域（梁呈元，2009;国家药典委员会，2015）。据《中国植物志》记载，我国有薄荷属植物12种，其中野生薄荷6种，广泛分布于全国各地，由于薄荷适应性强、有性和无性繁殖并存，自然杂交普遍导致很多生物性状的变异，研究薄荷种质资源的遗传多样性及亲缘关系，对薄荷地方种质资源的开发利用、保护及新品种选育具有重要意义。【前人研究进展】目前，有关薄荷的遗传多样性研究主要基于外部形态描述（朱梅等，2010）、染色体分型（于盱等，2009）、化学分型（陈小华，2013;杨倩，2017）等，但研究结果易受主观、环境等因素影响。由于分子标记技术能准确有效地进行种质资源鉴定和分析，已广泛应用于油菜（Lombard et al.，2000）、玉米（Sun et al.，2001）、烟草（祁建民等，2012）、薄荷（王海棠等，2012）、生姜（李秀等，2014）、薏苡（夏法刚等，2017）等种质鉴定和遗传多样性分析。Fenwick和Ward（2001）、房海灵等（2010）利用RAPD标记分析薄荷属植物种源间的遗传多样性，结果表明薄荷属植物种源间遗传多样性丰富，同一种类来源相同或相近的种源聚在一起，说明薄荷属种内的遗传关系与地理分布和环境差异存在一定相关性。Gobert等（2002）利用AFLP标记对62份薄荷种质资源进行聚类分析，结果表明这些种质资源可明显分为两大类群。Shasany等（2005）利用AFLP标記对薄荷资源的亲缘关系进行研究，结果表明，长叶薄荷（M. longifolia）与红薄荷（M. gentilis）的亲缘关系最近。乐云辰等（2008）利用ISSR标记对11个薄荷品种进行遗传多样性分析，结果表明，其遗传多样性较高，在遗传相似系数0.42的水平上，可将其分为4个类群。梁呈元等（2011a，2011b）利用ISSR标记对我国薄荷属7个种34个居群进行遗传多样性分析，结果表明薄荷资源存在丰富的遗传多样性，薄荷居群间的遗传变异大于居群内的变异。陈小华（2013）利用AFLP标记对28份薄荷种质资源进行遗传多样性分析，结果发现，其遗传相似系数为0.44～0.91，平均0.60，可分为7个类群。谢琳等（2013）利用ISSR标记对海南引种的14个薄荷种质资源进行遗传多样性分析，结果表明，其存在丰富的遗传变异。近5年鲜见利用分子标记研究薄荷遗传多样性和亲缘关系的文献报道。【本研究切入点】目前，大量研究证实单一的分子标记技术存在局限性，结合多种标记可更全面、准确地揭示种质遗传特性。由于SRAP标记用于检测基因编码框（ORF）区域的多态性，ISSR标记用于检测2个SSR间短DNA序列的多态性（祁建民等，2012），因此，综合二者可全面获取各种遗传变异信息，更准确揭示薄荷资源的遗传多样性和亲缘关系。我国贵州及西南地区薄荷资源丰富，但鲜见应用SRAP和ISSR标记分析薄荷种质资源遗传多样性及亲缘关系的研究报道。【拟解决的关键问题】利用SRAP和ISSR标记对来源不同的48份薄荷种质资源进行遗传多样性及亲缘关系分析，为薄荷种质资源的收集、保护及开发利用提供参考。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试的48份薄荷材料详见表1。各材料种植于贵州省农业科学院油料研究所香料试验地。主要试剂：2×Taq PCR MasterMix购自北京艾德莱生物科技有限公司，DL1500 DNA Marker、琼脂糖、30%聚丙烯酰胺、50×TAE Buffer等均购自宝生物工程（大连）有限公司。主要仪器：NanoDropTM ND-1000核酸蛋白测定仪（Thermo，美国）、C1000 Touch PCR仪（BIO-RAD，美国）、DYCZ-30C型双板夹芯式垂直电泳仪和DYY-6C型双稳定时电泳仪电源（北京六一生物有限公司）。

1. 2 样品采集

将48份薄荷种质材料进行小区（面积1 m×2 m）种植，每小区种植8株，各小区设2个重复。在晴朗的上午分别取各材料的顶部嫩叶，每份种质材料随机取3株混合，装于预冷的2 mL离心管，-80 ℃保存。

1. 3 DNA提取

采用改进的CTAB法提取DNA，在提取缓冲液中加入2% β-巯基乙醇和聚乙烯吡咯烷酮（PVP）以除去酚类和多糖类物质，分别采用1%琼脂糖凝胶电泳和核酸/蛋白测定仪检测DNA质量和浓度，并稀释至50 ng/μL，-20 ℃保存备用。

1. 4 SRAP和ISSR分析

SRAP引物由中国农业科学院油料研究所提供，其中正向引物36条，反向引物24条，可形成864对引物组合。ISSR引物为哥伦比亚大学（UBC）公布的100个引物序列，两种引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。从上述引物中筛选出扩增条带清晰、多态性丰富、稳定的20对引物，其中SRAP和ISSR引物各10对，用于后续试验，引物序列见表2和表3。PCR反应体系10.0 μL：2×Taq PCR MasterMix（含染料）5.0 μL、10 μmol/L正、反向引物各1.0 μL、50 ng/μL DNA模板0.5 μL，ddH2O补足至10.0 μL。每个PCR反应体系设2个重复。扩增程序：94 ℃预变性5 min;94 ℃ 30 s，55～50 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，进行10个循环;94 ℃ 1 min，50 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，进行30个循环;72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。PCR产物用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，用银染法显色，然后拍照记录。

1. 5 数据分析

观察电泳图谱，有条带记为1，无条带记为0。应用POPGENE 1.32计算多态性位点百分率，有效等位基因数（Ne）、Neis遗传多样性指数（H'）和Shannon信息指数（I）等，并利用NTSYS-pc 2.10e计算遗传相似系数（GS），采用UPGMA（非加权组平均法）进行聚类分析。

2 结果与分析

2. 1 薄荷种质资源的遗传多样性分析结果

利用筛选的10对SRAP引物对48份薄荷种质材料进行PCR扩增，共扩增出187条条带，平均每条引物扩增出18.7条;引物组合Me28/Em4扩增条带数（28条）最多，引物组合Me34/Em6扩增条带数（12条）最少（图1），其中多态性条带182条，多态性比率为97.33%。利用筛选的10个ISSR引物对48份薄荷种质材料进行扩增，共扩增出183条条带，平均每条引物扩增出18.3条，其中多态性条带178条，多态性比率为97.27%（图2）。可见，筛选的20对引物均具有较高的多态性检出率，可利用特异带型来区分不同的薄荷种质资源。

利用POPGENE Version 1.32对薄荷种质材料的遗传相关参数进行计算分析，结果显示，基于SRAP和ISSR标记分析获得48份薄荷种质材料的H'分别为0.1543和0.1803，I分别为0.2604和0.2923。综合两种分子标记的遗传相关参数进行遗传多样性分析，结果显示，48份薄荷种质材料的H'为0.1672，I为0.2762，说明供试薄荷种质材料的遗传多样性较丰富。

2. 2 薄荷种质资源的聚类分析结果

基于SARP和ISSR标记的多态性信息，应用NTSYS对48份薄荷种质材料进行聚类分析，结果如图3所示。当遗传相似系数为0.73，可将薄荷资源分为五大类，Ⅰ类包括43份材料，包含所有的留兰香、野生薄荷等资源;Ⅱ类包括2份材料，均为引进的薄荷资源;Ⅲ类为苹果薄荷，Ⅳ类为香槟薄荷，Ⅴ类为普列薄荷。说明苹果薄荷、香槟薄荷和普列薄荷与其他薄荷资源的亲缘关系较远，与形态标记的聚类分析结果（王少铭等，2018）一致。当遗传相似系数为0.79，Ⅰ类资源又可分為5个亚类，其中Ⅰa类包括33份从各地收集的留兰香和荷兰薄荷，Ⅰb类包括所有的野生薄荷和苏格兰薄荷，Ⅰc类包括胡椒薄荷和来自四川的薄荷，Ⅰd类包括小叶留兰香和普定薄荷，Ⅰe类仅包括来自兴义的薄荷。可见，薄荷种质资源聚类结果主要由品种差异决定，受地域影响较小。

2. 3 贵州薄荷种质资源的遗传多样性及聚类分析结果

为进一步分析贵州薄荷种质资源的多样性，利用POPGENE Version 1.32对33份贵州薄荷种质材料的SARP和ISSR标记多态性信息进行分析，结果显示，SARP与ISSR标记的多态性比率为78.65%，平均H'为0.1424，平均I为0.2341，说明贵州薄荷种质材料的遗传基础相对较窄，大部分材料亲缘关系较近。应用NTSYS对其进行聚类分析，结果（图4）显示，在遗传相似系数为0.76处，可将贵州薄荷资源分为四大类：i类包括28个材料，均为留兰香;ii类包括2个材料，分别为小叶留兰香和普定薄荷;iii类包括2个材料，均为野生薄荷;iv类只有1个材料，为来自兴义的薄荷。可见，虽然贵州薄荷资源遗传多样性较低，但能明显分为4个种类，且该分子标记聚类结果和农艺性状聚类结果（王少铭等，2018）基本一致，表明二者均能将留兰香、野生薄荷和小叶留兰香区分开来。

2. 4 不同来源薄荷种质资源的遗传多样性分析结果

将48份薄荷材料按照不同来源分为4个群体，分别为贵州群体、重庆群体（包括四川的BH06材料）、云南群体和引进群体（具体来源不详的资源），应用POPGENE Version 1.32对4个群体的SRAP和ISSR多态性条带进行分析，结果（表4）显示，引进群体的H'和I较高，分别为0.1680和0.2738;贵州群体的H?和I次之，分别为0.1450和0.2385;云南群体的H'和I较低，分别为0.0930和0.1404。因此，4个群体的遗传多样性排序为引进群体>贵州群体>重庆群体>云南群体。4个群体的遗传一致度和遗传距离如表5所示。贵州群体和云南群体的遗传一致度最高，说明二者的遗传背景最近;云南群体和引进群体的遗传一致度最低，说明二者遗传差异最大;贵州群体与引进群体遗传距离最大，与云南群体和重庆群体遗传距离较小，说明贵州群体、云南群体和重庆群体亲缘关系较近。

3 讨论

3. 1 薄荷资源遗传多样性及亲缘关系分析

本研究利用SRAP和ISSR两种分子标记分析48份薄荷种质资源，20对引物共扩增多态性条带370条，平均每对引物扩增出18.5条，高于房海灵等（2010）利用RAPD标记平均每对引物扩增出的多态性条带数（4.55条），表明SRAP和ISSR标记对薄荷种质资源的多态性检出率高于RAPD。SRAP和ISSR标记分析得到的48份薄荷资源的H'分别为0.1543和0.1803，I分别为0.2604和0.2923，表明虽然SRAP与ISSR标记的原理不一样（邵珠田，2017），但对薄荷种质资源的遗传多样性分析结果基本一致。

本研究聚类分析结果表明，引进的薄荷资源显著和其他薄荷资源区别开来，贵州的薄荷种质资源主要以留兰香类型为主，野生薄荷和小叶类型次之，还有遗传距离较远的兴义薄荷类型，表明贵州省的薄荷种质资源除前人报道（代正福和雷朝云，2001）的留兰香和野生薄荷之外，还有其他类型的种质资源，但要确定其遗传地位还需进一步研究。

3. 2 不同来源地和薄荷资源种间遗传分化

供试的48份薄荷种质资源按来源地进行遗传多样性分析，4个群体的遗传多样性表现为引进群体>贵州群体>重庆群体>云南群体，贵州群体与引进群体遗传距离最大，与云南群体和重庆群体遗传距离较小，其原因是贵州、云南和重庆归属于我国西南地区，地理环境和气候相似，薄荷种质特性也较相似，遗传多样性相对较低，主要以留兰香和野生薄荷为主，其中留兰香被当作新鲜调味料使用，多为房前屋后零星种植，分布范围广，遗传差异较小，遗传基础较狭窄，亲缘关系较近，而引进群体来自地中海和欧洲地区，来源范围广，表现出丰富的遗传多样性，亲缘关系较远。因此，薄荷种质资源的种间遗传分化明显，而同一种类不同来源地资源的遗传分化较小。这与房海灵等（2010）应用RAPD标记分析薄荷属（Mentha L.）7个种38个种源间的遗传多样性，结果发现同一种类来源相同或相近的种源聚在一起的结果一致。

4 結论

SRAP和ISSR标记对48份薄荷种质资源的多态性检出率较高。薄荷属种间具有丰富的遗传多样性，但种内遗传变异较小。与引进的薄荷资源相比，贵州的资源遗传基础相对较窄，与云南和重庆的资源亲缘关系较近。

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