葡萄籽原花青素对阿尔茨海默病模型大鼠学习记忆能力的改善作用及其机制研究

陈伟 李晓 陈美华 王晓丹 马健 王浩 张继国

中圖分类号 R965 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2018）13-1760-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.13.08

摘 要 目的：探究葡萄籽原花青素（GSP）对阿尔茨海默病（AD）模型大鼠学习记忆能力的改善作用及其机制。方法：将50只大鼠随机分为假手术组、模型组和GSP高、中、低剂量组（400、200、100 mg/kg），除假手术组外其余大鼠海马组织注射β-淀粉样蛋白1-42（Aβ1-42）建立AD模型，造模后48 h开始灌胃相应药物，假手术组和模型组大鼠灌胃相同体积的生理盐水，每日1次，连续给药21 d。给药14 d后采用新物体识别实验检测各组大鼠的新事物识别指数（TI）；从给药16 d开始进行Morris水迷宫实验，学习5 d记录逃避潜伏期，末次给药后记录探索潜伏期和探索次数，Western blot法检测大鼠海马组织中NOD样受体蛋白3（NLRP3）的表达水平；酶联免疫吸附法检测大鼠海马组织中白细胞介素6（IL-6）、IL-1β的含量。结果：5组大鼠Morris水迷宫学习5 d内的逃避潜伏期差异均无统计学意义（P>0.05）；与假手术组比较，模型组大鼠TI明显减小，探索潜伏期明显延长，探索次数明显减少，海马组织中NLRP3、IL-6、IL-1β水平均明显提高，差异具有统计学意义（P<0.05）。与模型组比较，GSP各剂量组大鼠探索潜伏期明显缩短，探索次数和TI均明显增加，海马组织中NLRP3、IL-6、IL-1β水平均明显降低，差异具有统计学意义（P<0.05）。结论：GSP可改善AD模型大鼠的记忆能力，其机制可能与抑制NLRP3炎性小体通路，减少炎症因子IL-6、IL-1β的产生有关。

关键词 葡萄籽原花青素；阿尔茨海默病；β-淀粉样蛋白1-42；NOD样受体蛋白3；炎症因子

ABSTRACT OBJECTIVE： To investigate the improvement effects and its mechanism of grape seed proanthoeyanidins （GSP） on learning and memory ability of Alzheimers disease （AD） model rats. METHODS： Totally 50 rats were randomly divided into sham operation group， model group and GSP high-dose， medium-dose and low-dose groups （400， 200， 100 mg/kg）. Those groups were given Aβ1-42 in hippocampus of rats to establish AD model except sham operation group and given relevant medicine intragastrically 48 h after modeling. Sham operation group and model group were given constant volume of normal saline intragastrically， once a day， for consecutive 21 d. 14 d after administration， new object recognition test was adopted to test new recognition index （TI）. Morris water maze test was conducted since 16 d after administration. The escape incubation period of rats were recorded 5 d during learning. Exploration incubation period and the times of exploration were recorded after last administration. Western blot was used to detect the expression of NLRP3 in rat hippocampus. ELISA was used to determine the content of IL-6 and IL-1β in rat hippocampus. RESULTS： There was no statistical significance in escape incubation period among 5 groups within 5 d of Morris water maze learning （P>0.05）. Compared with sham operation group， TI of model group was decreased significantly， while exploration incubation period was prolonged significantly； the times of exploration was decreased significantly； the levels of NLRP3， IL-6 and IL-1β in hippocampus were increased significantly， with statistical significance （P<0.05）. Compared with model group， exploration incubation period of GSP groups were shortened significantly， while the times of exploration and TI were increased significantly； the levels of NLRP3， IL-6 and IL-1β in hippocampus were decreased significantly， with statistical significance （P<0.05）. CONCLUSIONS： GSP can improve the memory ability of AD model rats， the mechanism of which may be associated with inhibiting NLRP3 inflammatory corpuscle pathway and reducing the generation of inflammatory factors as IL-6 and IL-1β.

KEYWORDS Grape seed proanthoeyanidins； Alzheimers disease；Aβ1-42；NLRP3； Inflammatory factors

阿尔茨海默病（Alzheimers disease，AD）是一种慢性中枢神经系统退行性疾病，发病率逐年升高，但其发病机制尚不明确，现有治疗方法效果均不甚满意[1]。β-淀粉样蛋白（β-amyloid protein，Aβ）聚集是AD患者脑内的主要病理学特征之一。Aβ沉积后激活小胶质细胞引起的炎症反应是AD的发病机制[2]。NLRP3炎性小体属于胞内模式识别受体NOD 样受体（NOD-like receptors，NLRs），在AD的发生发展中发挥了关键作用[3]。葡萄籽原花青素（Grape seed proanthoeyanidins，GSP）是从葡萄籽中提取的多酚类化合物，可改善血管性痴呆大鼠的学习记忆能力[4]，可保护Aβ25-35诱导的小鼠海马神经元损伤[5]，但对AD的作用尚未见公开报道。本研究以海马组织内注射Aβ1-42建立AD大鼠模型[6]，研究GSP对AD大鼠学习记忆能力的影响及其抑制炎症反应的可能机制，为GSP治疗AD提供实验依据。

1 材料

1.1 仪器

5804 R型高速台式低温离心机（德国Eppendorf公司）；STRONG-Ⅱ型脑立体定位仪（深圳瑞沃德生命科技有限公司）；INFINITE200 pro型多功能酶标仪（瑞士Tecan公司）；Powerpac Basic型垂直电泳、电泳槽及转膜系统（美国Bio-Rad公司）。

1.2 药品与试剂

GSP原料药（陕西省天之润生物科技有限公司，批号：TZR20140825，纯度：95.36%）；BCA蛋白试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号：20161109）；ECL化学发光检测试剂盒（美国Thermo Scientific Pierce公司）；Aβ1-42（美国Sigma公司，批号：A9810，纯度：≥95%）；白细胞介素6（IL-6）和IL-1β酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（上海蓝基生物科技有限公司，批号：20161223、20161008）；NLRP3抗体（美国Santa Cruz公司）；β-肌动蛋白（β-actin）抗体、辣根过氧化酶（HRP）标记的山羊抗兔二抗和山羊抗鼠二抗（北京中杉金桥生物公司）。

1.3 动物

SPF级8周龄SD大鼠，♂，体质量180～220 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号：SCXK（京）2012-0001。本实验通过泰山医学院伦理委员会批准。

2 方法

2.1 分组与给药

所有大鼠自由饮食饲养7 d，按随机数字表法分组，分为假手术组、模型组和GSP高、中、低剂量组（400、200、100 mg/kg），每组10只，GSP给药剂量按文献[4]与预实验确定。GSP以生理盐水制备混悬液，用前摇匀。造模48 h后各组大鼠开始灌胃相应剂量的药物，假手术组和模型组灌胃相同体积的生理盐水，每天1次，連续21 d。

2.2 建模

实验前一周以生理盐水将白色干粉Aβ1-42溶解制成5 μg/μL溶液，并置于37 ℃温箱中孵育1周，老化为具有神经毒性的凝聚状态的Aβ1-42。大鼠麻醉后固定于脑立体定位仪，暴露前囟，以前囟为原点，向后4.0 mm，旁开2.5 mm穿刺点转穿颅骨，自脑表面进针3 mm，将2 μL凝聚状态Aβ1-42在10 min内缓慢注入海马组织CA1区，假手术组注入等量生理盐水，留针5 min以保证其充分扩散；缓慢退针，局部消毒并缝合皮肤[6]。

2.3 新物体识别实验

首次给药14 d后各组大鼠进行新物体识别实验评价大鼠的学习能力[7]。实验分为适应、训练和测试三个阶段。适应阶段中，将大鼠逐个放入空箱中适应环境，每只大鼠适应10 min。24 h后开始训练，将2个完全一样的物体A放入行为箱的2个角落并固定，然后逐个放入大鼠探究学习A，训练10 min；间隔1 h后进入测试阶段，将行为箱中的其中一个物体A换成颜色、形状均不同的新物体B，记录大鼠对物体A和B的探究时间，分别表示为TA和TB，每只大鼠的测试时间为5 min，计算新物体识别指数TI=（TB-TA）/（TB+TA）。每只大鼠实验结束后清除粪便，并用75%乙醇擦拭行为箱和物体，清除排泄物及残留味道。

2.4 Morris水迷宫实验

实验分为定位航行实验和对位空间探索实验两部分[6]。给药后第16天开始进行定位航行实验评价大鼠的学习能力，在第一象限放置隐蔽平台，选任一象限将大鼠面向池壁放入水池，记录大鼠从入水至爬上隐蔽平台所需的时间，即为逃避潜伏期。如2 min内大鼠未找到隐蔽平台，则将大鼠引导至平台并停留10 s，并将逃避潜伏期记录为2 min。每天训练4次，计算所需时间的平均值为当天的逃避潜伏期，连续训练5 d，每天固定时间段训练。给药21 d后进行对位空间探索实验评价大鼠的记忆能力，即将隐蔽平台撤掉，在原放置平台的对位象限处放入大鼠，记录大鼠首次进入原平台位置的时间，即探索潜伏期，并记录2 min 内大鼠进入原平台区的次数，即探索次数。

2.5 Western blot法检测海马组织中NLRP3表达水平

对位空间探索实验后，处死大鼠，分离脑海马组织，-80 ℃冻存。用含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液匀浆后冰上裂解30 min，4 ℃下12 000×g离心20 min，经BCA蛋白试剂盒测定蛋白浓度，加上样缓冲液后煮沸5 min。取30 μg总蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），凝胶蛋白电转至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，8%脱脂奶粉封闭4 h，β-actin（1 ∶ 2 000）、NLRP3（1 ∶ 800）抗体室温孵育2 h，4 ℃过夜，TBST缓冲液充分洗膜后，经山羊抗鼠二抗、山羊抗兔二抗室温孵育2 h，加ECL于凝胶成像系统中曝光显影。应用Image J软件检测灰度值，以β-actin为内参，以NLRP3与内参灰度值的比值表示海马组织中NLRP3的相对表达量。实验重复3次。

2.6 ELISA法测定大鼠海马组织中IL-6、IL-1β的含量

取大鼠海马组织，4 ℃下1 500×g离心20 min，收集上清液，经BCA蛋白试剂盒测定蛋白浓度。上清液加入平衡液，根据IL-6、IL-1β ELISA试剂盒说明书，样品加入预先包被IL-6、IL-1β抗体的酶标板孔中，于37 ℃反应1 h，充分冲洗酶标板孔，再与HRP酶底物共同孵育显色，加入终止液，应用酶标仪于450 nm波长处测定吸光度，计算IL-6、IL-1β的含量。实验重复 3次。

2.7 统计学方法

用GraphPad Prism 5.0软件进行统计处理，各组数据均以x±s表示，多组间比较采取单因素方差分析，组间两两比较应用 SNK-q检验，检验水准α=0.05，以P<0.05表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 TI

与假手术组比较，模型组大鼠的TI明显减少（P<0.05），提示注射Aβ1-42会损害大鼠的学习记忆能力。与模型组比较，GSP高、中、低剂量组大鼠的TI明显增加（P<0.05），且各剂量组间差异无统计学意义（P>0.05），提示从灌胃GSP 14 d开始已经发挥改善学习能力的作用。各组大鼠的TI测定结果见表1。

3.2 逃避潜伏期

与假手术组比较，模型组大鼠学习期内的逃避潜伏期均有所延长，但差异均无统计学意义（P>0.05）。与模型组比较，GSP高、中、低剂量组大鼠学习期内的逃避潜伏期均有缩短，但差异均无统计学意义（P>0.05）。各组大鼠学习期内的逃避潜伏期见表2。

3.3 探索潜伏期与探索次数

与假手术组比较，模型组大鼠的探索潜伏期明显延长（P<0.05），探索次数明显减少（P<0.05）；与模型组比较，GSP高、中、低剂量组大鼠的探索潜伏期均明显缩短（P<0.05），探索次数明显增加（P<0.05），但各剂量组间差异无统计学意义（P>0.05）。各组大鼠的探索潜伏期和探索次数见表3。

3.4 海马组织中NLRP3的表达

与假手术组比较，模型组大鼠海马组织中NLRP3的相对表达量明显增加（P<0.05）；与模型组比较，GSP高、中、低剂量组大鼠海马组织中NLRP3的相对表达量明显减少（P<0.05），但各剂量组间差异无统计学意义（P>0.05）。各组大鼠海马组织中NLRP3表达的电泳图见图1，测定结果见表4。

3.5 海马组织中IL-6、IL-1β含量的变化

与假手术组比较，模型组大鼠海马组织中IL-6、IL-1β的含量明显增加（P<0.05）；与模型组比较，GSP高、中、低剂量组大鼠海马组织中IL-6、IL-1β的含量明显减少（P<0.05），但各剂量组间差异无统计学意义（P>0.05）。各组大鼠海马组织中IL-6、IL-1β的含量见表5。

4 讨论

随着人口老龄化进展，AD成为危害公共健康最严重的疾病，医学工作者一直在努力探索AD的发病机制，并提出胆碱能学说、tau蛋白磷酸化学说及Aβ学说等，其中Aβ学说占据主导地位[8]。目前关于炎症学说的研究愈渐增多[2]，研究认为Aβ沉积可以激活小胶质细胞，释放炎症因子，最终导致神经元凋亡或死亡[3]。还有研究证实，某些化合物如积雪草苷通过减少IL-6、TNF-α的生成抑制炎症反应，可以保护AD模型大鼠学习记忆能力[6]。

GSP是从葡萄籽中提取的多酚类化合物，具有广泛的药理作用，如抗肿瘤[9]、肝保护[10]等。有研究认为GSP可通过抗氧化作用改善血管性痴呆模型大鼠的空间学习记忆等[4]，但GSP对AD的作用及机制尚未见文献报道。本实验采用经典的向海马组织中注射Aβ1-42的方法建立AD大鼠模型，探究GSP对AD模型大鼠学习记忆能力的改善作用。结果表明，GSP在第14天时即可明显增加AD模型大鼠的TI，表现出明显的改善AD模型大鼠学习记忆能力的作用。随后本研究通过Morris水迷宫实验验证GSP治疗AD的效果，其中定位航行实验学习期持续5 d，经重复训练，大鼠均能找到隱蔽平台，GSP具有缩短AD模型大鼠的逃避潜伏期的趋势；第21天对位空间探索实验中，GSP可明显缩短AD模型大鼠的探索潜伏期，增加探索次数，进一步表明GSP可以改善AD模型大鼠的学习记忆能力。

NLRP3炎性小体的结构由NLR蛋白、凋亡相关点样蛋白（ASC）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（Caspase-1）的前体（pro-Caspase-1） 组成，NLR 蛋白可以识别配体和危险信号，比如Aβ及细菌、病毒的DNA等，ASC 通过CARD结构域募集并激活效应蛋白pro-Caspase-1[11]。NLRP3炎性小体是目前研究最多的炎性小体，在中枢神经系统中存在于星形胶质细胞和小胶质细胞中，NLRP3炎性小体参与AD的发生发展过程[12]，这一理论为 AD 治疗的研究提供新靶点和新思路。实验证实，激活NLRP3炎性小体，可以增加APP/PS1双转基因小鼠脑内Aβ堆积，加快AD病理演变进程，而NLRP3的基因缺失，可促进Aβ的消除，明显改善APP/PS1双转基因小鼠空间记忆障碍[13]。本实验发现，GSP给药21 d时可明显减少注射Aβ1-42的海马组织中NLRP3的表达，表明GSP可以抑制Aβ1-42诱导的NLRP3炎性小体活化，发挥抗炎作用。

NLRP3炎性小体活化，可通过Caspase-1剪切无活性的促炎细胞因子 IL-6、IL-1β的前体成为成熟的IL-6、IL-1β等炎症因子[14]。IL-6、IL-1β等炎症因子可激活胶质细胞中核因子κB（NF-κB），使细胞因子上调，并且通过激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）-p38 信号增强神经元中Aβ分泌酶1（BACE1）蛋白的活性，增加Aβ的合成和沉积[15]。本实验还发现，GSP可明显减少大鼠海马组织中IL-6、IL-1β的含量，据此推测GSP可能通过抑制 Aβ1-42诱导的NLRP3炎性小体活化，减少IL-6、IL-1β的生成，进而发挥保护AD大鼠学习记忆能力的作用。但GSP抑制NLRP3炎性小体活化的具体机制尚不明确，还需进一步深入研究。

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（收稿日期：2018-01-10 修回日期：2018-05-16）

（编辑：邹丽娟）