番木瓜感染畸形花叶病毒后的生理变化及扫描电镜观察

安娜 张荣萍 陈萍

摘要：【目的】闡明番木瓜畸形花叶病毒（Papaya leaf-distortion mosaic virus，PLDMV）的侵染机理及侵染后番木瓜自身防御体系对抗病毒的作用机制，为番木瓜病毒病防治提供参考。【方法】以台农二号番木瓜为材料，通过RT-PCR检测接种PLDMV处理组（T）与健康空白对照组（CK）的病毒感染情况，采用分光光度法测定PLDMV侵染对番木瓜相关生理指标的影响，运用扫描电镜法观察两组番木瓜叶片的微观结构差异。【结果】通过RT-PCR检测，证明T番木瓜植株已感染PLDMV。T与CK番木瓜叶片在表征、微观解剖结构及生理指标等方面均存在明显差异，与CK番木瓜叶片相比，T番木瓜叶片纵切面栅海比及背部绒毛密度明显小于CK番木瓜，气孔密度大于CK番木瓜；T番木瓜的过氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性和脯氨酸（Pro）、丙二醛（MDA）、超氧阴离子（[O] ）含量均显著高于CK番木瓜（P<0.05，下同），过氧化氢酶（CAT）活性和叶绿素（Chl）含量显著低于CK番木瓜，而超氧化物歧化酶（SOD）和几丁质酶活性两组间无显著差异（P>0.05）。【结论】番木瓜受PLDMV侵染后，其叶片结构被破坏，细胞毒害损伤严重，体内代谢紊乱，多种代谢调节平衡被打破，番木瓜的正常生长发育受阻。

关键词： 番木瓜；番木瓜畸形花叶病毒（PLDMV）；扫描电镜

中图分类号： S668.2 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）04-0714-07

Physiological changes and scanning electron microscope observation of Carica papaya L. infected with PLDMV

AN Na， ZHANG Rong-ping， CHEN Ping*

（Institution of tropical agriculture and forestry， Hainan University， Haikou 570228， China）

Abstract：【Objective】The infection mechanism of Papaya leaf-distortion mosaic virus（PLDMV） and the mechanism of Carica papaya L. defense system against virus after infection were elucidated to provide reference for papaya virus di-sease. 【Method】C. papaya variety Tainong 2 was used as material. The infection situations of C. papaya in treatment group with PLDMV inoculation（T） and healthy blank control group（CK） were confirmed by RT-PCR detection. The influence of PLDMV infection on C. papaya related physiological indexes was determined by spectrophotometry. Scanning electron microscopy was used to observe the difference in microstructure between the two groups. 【Result】RT-PCR test showed that T group was infected with PLDMV. There were obvious differences in the characterization， microstructure and physiological indexes between leaves in T and CK. Palisade tissue to cavernous tissue ratio of vertical section leaves and density of back tomentum in T were smaller than those in group CK， and the stomatal density in group T was larger than that in group CK. In physiological indexes， the activities of peroxidase（POD）， polyphenol oxidase（PPO） and phenylalanine ammonia lyase（PAL）， and contents of proline（Pro）， malondialdehyde（MDA） and superoxide anion（[O] ） in T group were significantly higher than those in CK group（P<0.05， the same below）. Catalase（CAT） activity and chlorophyll（Chl） content in T group was significantly lower than those in CK group. Superoxide dismutase（SOD） and chitinase were not signi-ficantly different from each other（P>0.05）. 【Conclusion】After PLDMV infection， C. papaya leaf structure is damaged， the cells are seriously poisoned， metabolic disturbance occurs， multiple metabolic regulation are imbalanced， therefore， the development and growth of papaya is blocked.

Key words： Carica papaya L.； Papaya leaf-distortion mosaic virus（PLDMV）； scanning electron microscope

0 引言

【研究意义】番木瓜（Carica papaya L.）属大型软木质多年生草本植物，其作为南方地区一种主栽水果深受消费者喜爱，但栽培过程中常遭受番木瓜畸形花叶病毒（Papaya leaf-distortion mosaic virus， PLDMV）侵染，受害番木瓜的产量和品质严重下降，给果农造成巨大的经济损失。寻找方便高效的番木瓜畸形花叶病毒病防治措施对促进番木瓜产业发展尤为重要，但至今尚无十分有效的防治手段，因此，全面了解该病毒病的发病症状及感病番木瓜植株的生理情况，对今后从多角度寻找有效的番木瓜病毒病防治方法具有重要意义。【前人研究进展】番木瓜畸形花叶病毒病是一种主要流行于日本及我国台湾地区、在番木瓜间传播的病毒病，可危害番木瓜植株的叶片及果实，2013年时检测发病率达3%（杨勇等，2013），近年来呈逐渐上升趋势。目前，对于该病毒的鉴定检测技术已非常成熟。霍鹏（2015）利用多重荧光定量PCR鉴定番木瓜病毒，该方法比PCR灵敏10～100倍；庹德财（2015）通过建立并优化多重PCR反应，可同时进行包括PLDMV在内的3种番木瓜病毒鉴定；吴自林和李华平（2016）运用RT-PCR对18个采集自广州南沙区的番木瓜感病样品进行检测，结果从中检测到13个样品为番木瓜畸形花叶病毒。在番木瓜病毒病的防治方面，张荣萍等（2017）通过对番木瓜进行多种植物免疫药剂的正交试验，发现壳聚糖、碧护和酵素菌复配处理对番木瓜幼苗环斑病毒病有较好的控制效果。【本研究切入点】目前关于PLDMV感染番木瓜后植株的生理病理变化尚无文献报道，且其发病后病叶的微观结构变化也鲜有报告。【拟解决的关键问题】采用分光光度法和扫描电镜法，结合RT-PCR分子检测，比较受PLDMV侵染的番木瓜植株与正常植株的生理代谢及叶片超微结构的差异，阐明其致病机理，为番木瓜病毒病防治提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试番木瓜苗为台农二号，种苗来自广东惠州旺发果苗场。挑选长势相同、健康无病症的番木瓜苗进行培养，处理组（T）番木瓜苗在50 cm高时接种PLDMV，对照组（CK）不接种病毒并进行隔离，其他环境条件相同，CK与T均有10棵苗。PLDMV来源于中国热带农业科学院生物技术研究所。主要试剂：植物总RNA提取试剂盒[DP437，离心柱型，天根生化科技（北京）有限公司]、反转录试剂盒TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix（AT311-02，北京全式金生物技术有限公司）、2×EasyTaq PCR SuperMix（-dye）（AS111-02，北京全式金生物技术有限公司）。

1. 2 试验方法

于2017年9月进行病毒接种，2017年10月发病后进行扫描电镜观察及生理指标测定。

1. 2. 1 病毒接种 病毒接种采用摩擦接种法，参考孙玉娟等（2011）的方法并略有改进。摘取已严重发病的番木瓜病株嫩叶1 g，剪碎用液氮充分研磨，按1∶100比例加入100 mL磷酸缓冲液与少量石英砂研磨成匀浆，用干净纱布将残渣过滤掉，滤液低温保存，并立刻进行病毒接种。接种前以肥皂洗净双手，用食指沾取少量病毒提取液后再沾取少量石英砂，大拇指与食指捏住叶片进行轻微摩擦，擦破叶表面即可。选择从顶端往下数第4和第5片功能叶进行接种试验。

1. 2. 2 田间观测 接种2周后植株陆续出现发病症状。每组选取3株发病程度基本一致的番木瓜苗，摘取从顶端往下数第2和第3片功能叶，其中一片将叶柄剪去进行拍照，另一片用于后续试验。

1. 2. 3 发病植株PCR分子检测 参照庹德财（2015）的方法，用植物总RNA提取试剂盒提取RNA，根据PLDMV保守区设计引物进行RT-PCR检测（片段大小为355 bp；正向引物PLDMV355-F：5'-GGCATGT

GGTTTATGATGCAAGGG-3'，反向引物PLDMV355-

R：5'-GCTCCGTGTTCTCAGTCGCATT-3'）。按照反转录试剂盒TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix说明转录合成cDNA；反转录程序：25 ℃ 10 min，42 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃结束反应。PCR扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，进行30个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳（2%的Agarose），选用TaKaRa DL2000 DNA Marker进行标定，电泳条件为100 V 25 min，观察条带分布以确认T植株的病毒感染情况。

1. 2. 4 扫描电镜观察 参照李和平（2009）的方法并稍作修改。叶片洗净擦干，用刀片切成直径小于2 mm的切片，迅速投入2.5%戊二醛固定液中浸泡2 h，再用真空泵将叶片中的气泡抽出，继续浸泡8 h以上。固定好的切片用磷酸缓冲液进行漂洗，阶梯浓度酒精进行逐级脱水，每次8 min，脱水完毕用乙酸异戊酯置换酒精，然后再进行超临界干燥和喷金，最后上扫描电镜观察叶片正面、背面及横切面并拍照。

1. 2. 5 生理指标测定 用剩余叶片分别进行10个生理指标的测定。过氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）活性和叶绿素（Chl）含量测定参考蔡庆生（2013）的方法并适当调整，超氧阴离子自由基（[O][2] ）含量测定参照陈银萍等（2015）的方法，丙二醛（MDA）含量測定采用张琦等（2016）的方法，脯氨酸（Pro）含量测定参考张乐华等（2011）的方法，几丁质酶活性测定参考Yin等（2013）的方法，苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性测定参照陈建勋和王晓峰（2015）的方法。

1. 3 统计分析

采用Excel 2013进行数据处理与作图，用SAS 9.4进行数据方差分析（ANOVA），采用t检验（P=0.05）进行数据差异显著性检验。

2 结果与分析

2. 1 发病叶片症状描述

2017年10月1日，采摘番木瓜顶端往下数完全舒展的第2或第3片叶进行观察、拍照。如图1所示，CK番木瓜植株叶片的叶色呈墨绿色，叶色均匀，叶片舒展，叶脉无扭曲变形现象，而T番木瓜植株的叶片叶色不均匀且有色斑，黄绿相间，靠近叶脉辐射中心处有明显的扭曲变形现象。

2. 2 PLDMV感染情况的RT-PCR检测结果

由图2可知，PCR扩增产物在T1、T2和T3泳道有明显条带，位置在250～500 bp，与PLDMV阳性对照显示的条带（355 bp）平行。说明T番木瓜植株确实感染了PLDMV，且病毒在植株中的表达量已能够被检测出，而CK番木瓜植株均未检测出条带，说明CK番木瓜未感染PLDMV。

2. 3 扫描电镜超微结构观察结果

扫描电镜下观察发现，CK与T番木瓜的叶上表面（叶面）无明显差异，叶表皮细胞均排列紧密（图3-1和图3-2）。叶下表面（叶背）包含形成气孔的保卫细胞及叶背毛，CK与T番木瓜的叶背面细胞存在差异：（1）CK番木瓜叶背面构成气孔的保卫细胞与相邻的副保卫细胞较饱满，细胞偏大，相同放大倍数相同视野下，CK番木瓜的气孔个数为3个且不完全闭合，而T番木瓜的气孔个数为4个且全部处于闭合状态；（2）CK番木瓜的叶片绒毛密度比T番木瓜的绒毛密度大，T番木瓜可见明显的裸露区域（图3-3和图3-4）。从叶片的纵切面扫描电镜照片（图3-5和图3-6）可看出，CK番木瓜有明显宽大的栅栏组织，而T番木瓜的栅栏组织细胞排列散乱，占横切面的比例不足1/3，且CK番木瓜的栅栏组织排列紧密整齐，可清晰辨认；CK与T番木瓜的海绵组织在扫描电镜下观察无明显差异，均散乱分布于栅栏组织下方，且大小不一。

2. 4 生理指标测定结果

2. 4. 1 植物抗氧化相關指标测定结果 由图4-A～图4-D可看出，番木瓜植物在受到病原攻击时其POD和PPO活性显著高于CK（P<0.05，下同），而CAT活性显著低于CK，SOD活性高于CK番木瓜但差异不显著（P>0.05，下同）。细胞中[O][2] 含量越高，细胞越容易受到攻击，细胞新陈代谢失衡的可能性就越大。图4-E显示，T番木瓜的[O][2] 含量显著高于CK番木瓜。从图1可直接观察到CK番木瓜的叶色明显比T番木瓜的深，而图4-F也证实CK番木瓜的Chl含量显著高于T番木瓜。

2. 4. 2 与植物抗逆相关的主要指标测定结果 MDA含量能反应植物细胞的膜质过氧化程度，一般而言，MDA含量越高，意味着植物中膜质过氧化程度越高，损伤也就越严重。由图5-A可看出，T的MDA含量显著高于CK番木瓜，该指标与[O][2] 含量的测定结果可同时证明T细胞的受损程度大于CK番木瓜。Pro含量和PAL活性与植物抗逆性相关，Pro含量越高，说明植物受到的胁迫越剧烈，相反则越低；PAL在植物体内的次生代谢中起重要作用，植物受到胁迫时其活性会显著增加。由图5-B和5-C可看出，T番木瓜的Pro含量和PAL活性均显著高于CK。近年来有报道几丁质酶活性与植物抗逆相关，通过提高几丁质酶活性可水解微生物细胞壁，从而保护植物自身免受微生物的侵害（徐恩静等， 2011）。由图5-D可看出，CK与T番木瓜中的几丁质酶活性相当，两者间差异不显著。

3 讨论

本研究结果显示，当番木瓜叶片受到病原侵害造成伤害时其[O][2] 含量迅速上升，对细胞造成氧化伤害， T番木瓜的CAT活性低于CK番木瓜且SOD活性无明显上升，与花生感染条纹病毒后的表现相似（董炜博等，1997）；[O][2] 没有被及时清除可能是造成细胞中[O][2] 积累的原因，进而导致细胞膜质产生过氧化，与赵天宏等（2008）的报道相似。本研究中T番木瓜的POD和PPO活性显著高于CK番木瓜，与毛健民等（2002）报道烟草感染花叶病毒后的生理生化变化趋势一致，可能由于POD活性提高是植物对病原微生物侵染的一种积极反应，是一种自身防护机能的表现，也有可能是胁迫产生的次生代谢产物如酚类、胺类等的积累诱导了这两种酶活性升高，在这里笔者更倾向于后者，因为这两种酶是植物中的末端氧化酶，PPO可催化各种酚类物质氧化成醌类以避免其对细胞的毒害，POD可清除活性氧催化H2O2直接氧化酚类和胺类等底物（杨志敏和蒋立科，2010）。病叶中Pro含量高，说明植物正遭受逆境胁迫。PAL活性升高，与前述POD和PPO活性同时升高的试验结果相联系，也证明植物体内有害次生代谢产物存在积累现象，而有害次生代谢产物积累过多所造成的毒害也是植物细胞受损的一个重要原因。本研究中，CK与T番木瓜的几丁质酶活性无明显差异，说明病毒的刺激并未激活植物提高自身的几丁质酶活性。

从扫描电镜观察结果可看出，PLDMV对番木瓜叶片结构的破坏程度大、栅海比失衡，与李琴等（2010）对冬枣锈病病叶解剖结构观察、付春霞（2014）对苹果小叶病叶片横切面显微结构观察结果一致。而发病番木瓜叶背面与健康番木瓜植株相比，发病叶片气孔全部闭合，与倪国仕（2010）等在烟草中的研究结果一致，其原因可能是植物在受到逆境胁迫时会通过关闭气孔、改变细胞的渗透调节及增加细胞中的活性氧等以对抗病原体入侵，但同时抑制植物的正常光合作用，导致叶片光合速率下降，进而影响植物的正常光合代谢与发育，也有可能是病毒对正常细胞攻击而导致正常叶片结构破坏，致使气孔保卫细胞发育异常。通过彩色照片对比可看出，病叶扭曲变形，不完全伸展，且根据叶绿素含量在两组间的测定结果，CK番木瓜的叶片叶绿素含量明显高于T番木瓜，与毛健民等（2002）在烟草、于力等（2012）在番茄上的研究结果一致，其原因是病毒破坏了叶绿体结构，从而降低叶片光合作用效率，结合扫描电镜观察结果，病毒刺激导致叶片气孔部分关闭和叶肉细胞的光合活性降低。本研究结果显示，PLDMV对番木瓜叶片叶绿素的破坏程度较大，能影响叶绿素的合成，从而阻碍植物的光合作用，导致叶片的正常生理过程受阻，妨碍碳水化合物的积累。病毒对番木瓜叶片中正常组织的侵染使细胞中活性氧类物质积累，同时打破了细胞内活性氧类物质产生与清除的动态平衡，这些活性氧以其极强的氧化性造成细胞膜脂过氧化反应，对植物造成严重伤害（张梦如等，2014）。同时，病毒的大量繁殖导致植物叶片分化异常，叶绿体基本结构和功能遭到破坏，不能发育成形态正常的叶片，从而影响植物光合作用，植物生长受抑制（洪健等，2001）。由上述研究结果及分析讨论可以看出，无抗病性的番木瓜其自身的抗病能力有限，且其整个防御系统很容易失衡，不能有效抵抗病毒颗粒的入侵，今后可从提高植物自身免疫抗性角度进行更深入研究。

PLDMV的危害程度极大，需要引起重视，尤其随着农产品进出口量的大幅增长，病毒的传播速度加快，如何有效地预防该病毒的传播及对番木瓜的侵染，如何找到有效的防治方法是今后研究的重要方向。

4 结论

番木瓜被PLDMV侵染发病后，其叶片结构被破坏，栅海比变小，细胞毒害损伤严重，使植物体内代谢紊乱，多种代谢调节平衡被打破，严重影响番木瓜正常生长发育。

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（责任编辑 麻小燕）