基于dnaJ基因的弧菌PCR检测方法

陈静　童桂香　黄鸾玉　黎小正　吴祥庆　黄国秋　谢宗升　熊建华　谭红连　韦信贤

摘要：【目的】建立一种能扩增dnaJ基因全长的PCR检测方法，为弧菌的快速筛查及种类鉴定提供技术支持。【方法】以弧菌dnaJ基因为靶基因，在其首尾的保守区域设计一对简并引物，经优化退火温度和引物浓度，建立能扩增弧菌接近全长dnaJ基因的PCR检测方法，并通过特异性试验、灵敏度试验和临床应用评价等验证其适用性。【结果】优化后的PCR反应体系50.0 μL：2×F8 FastLong PCR MasterMix 25.0 μL，上、下游引物（20 μmol/L）各2.0 μL，DNA模板5.0 μL，灭菌水补足至50.0 μL。扩增程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，进行35个循环；最后72 ℃延伸5 min。该PCR检测方法对副溶血弧菌、哈氏弧菌、创伤弧菌、河流弧菌、溶藻弧菌、拟态弧菌、霍乱弧菌和栖黑海弧菌等8种弧菌属细菌具有很强的特异性，对弧菌的最低检出限为102 CFU/mL。应用建立的PCR检测方法对51株分离自海水样品的弧菌和32株分离自对虾样品的弧菌进行检测，结果显示全部为阳性，其中，海水样品中包括有副溶血弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌、河流弧菌、哈氏弧菌和栖黑海弧菌，对虾样品中包括副溶血弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌、河流弧菌和哈氏弧菌；经测序及同源性比对分析发现，种间菌株的dnaJ基因序列相似度为79.5%～92.8%，种内菌株间的dnaJ基因序列相似度为98.2%～99.9%。【结论】基于dnaJ基因建立的弧菌PCR检测方法能扩增出弧菌接近全长dnaJ基因，具有快速便捷、灵敏准确、适应性好等优点，结合测序技术，可为弧菌快速筛查及种类鉴定提供更全面和更准确的技术手段。

关键词： 弧菌；dnaJ基因；PCR检测；鉴定

中图分类号： S941.42 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）06-1228-07

Abstract：【Objective】A PCR detection method that could amplifiy full length of dnaJ gene was developed in order to provide technical support for rapid detection and identification of Vibrio species. 【Method】Taking dnaJ gene of Vibrio as target gene， a pair of degenerate primers were designed on the beginning and the end conserved domain. Then a PCR detection method that could amplify almost full length dnaJ gene of Vibrios was developed following optimization of annea-ling temperature and primers concentrations. The specificity and sensitivity tests， detection for clinical samples were carried out to evaluate the applicability of this method. 【Result】The optimized PCR ampli?cation reactions 50.0 μL：2×F8 FastLong PCR MasterMix 25.0 μL included 2.0 μL for upstream primer and downstream primer， 5.0 μL of the template and nuclease free water to a ?nal volume of 50.0 μL. PCR ampli?cation was carried out as follows： 3 min initial denatu-ration step at 94 ℃， followed by 35 cycles of 94 ℃ for 10 s， 55 ℃ for 15 s， and 72 ℃ for 15 s， with a ?nal extension step of 5 s at 72 ℃. The method showed strong specificity for V. parahaemolyticus， V. harveyi， V. vulnificus， V. fluvialis， V. alginolyticus， V. mimicus， V. cholerae and V. ponticus， and its detection sensitivity can reach 102 CFU/mL. Detected by the PCR method established， the results of 51 Vibrios strains isolated from seawater samples and 32 Vibrios strains isolated from Penaeus vannamei samples were positive. The 51 Vibrios strains isolated from seawater samples contained strains V. parahaemolyticus， V. harveyi， V. vulnificus， V. fluvialis， V. alginolyticus and V. Ponticus； and 32 Vibrios strains isolated from P. vannamei samples contained V. parahaemolyticus， V. harveyi， V. vulnificus， V. fluvialis and V. alginolyticus. Sequencing analysis and homology alignment of above 83 Vibrios showed that interspecific dnaJ gene sequence similarities reached 79.5%-92.8%， and intraspecies dnaJ gene sequence similarities reached 98.2%-99.9%. 【Conclusion】The method developed base on dnaJ gene in this study can amplify almost full length dnaJ gene of Vibrios， and is fast， convenient， sensitive， accurate and adaptable.It can provide all-around and rapid detection of Vibrios and identification of Vibrio species along with sequencing analysis.

Key words： Vibrios； dnaJ gene； PCR detection； identification

0 引言

【研究意义】弧菌属（Vibrio spp.）是一群菌体短小、弯曲成弧状或逗点状的革兰氏阴性菌，广泛存在于自然界中，以海水中最多，是一种常见的条件致病菌，在水体富营养化的养殖环境下可迅速繁殖，引起养殖动物暴发弧菌病。据水产病害监测数据显示，弧菌病已成为海水养殖中最常见、流行广、危害大的一类疾病（胡梦华，2015）。此外，部分弧菌感染人体后可引起腹泻、创伤感染或中耳炎等（Li et al.，2009），近年来因致病性弧菌引发的卫生健康事件时有报道（郑建成等，2015；陈小敏等，2017）。目前，弧菌检测主要采用传统的生化鉴定，需经增菌、分离纯化、染色、生化鉴定等步骤，操作过程烦琐，检测周期长（东秀珠和蔡妙英，2001），且不适应大量样本分析及快速检测的需求。因此，开展弧菌快速检测及种间鉴定技术研究对有效控制弧菌病的发生与流行、保障海水养殖业健康发展及公共卫生安全均具有重要意义。【前人研究进展】在细菌分类学上，16S rRNA基因和管家基因序列分析均可用于细菌种属的分子鉴定（Stackebrandt et al.，2002），但由于弧菌存在16S rRNA基因多拷贝现象，导致上述两种方法在弧菌鉴定上的应用存在局限性和不确定性（阎永伟，2013）。管家基因hsp60（Kwok et al.，2002）、gapA（Nishiguchi and Nair，2003）、gyrB（Le Roux et al.，2004）、recA、rpoA和pyrH（Thompson et al.，2005）也曾应用于弧菌种类鉴定及系统发育研究，其中，hsp60、gapA和gyrB基因仅能鉴定少数种类，而recA、rpoA和pyrH被认为是弧菌种类鉴定强有力的分子标记（Thompson et al.，2004），但利用这些管家基因仍无法有效区分海神弧菌（V. neptunius）与溶珊瑚弧菌（V. coralliilyticus）、鳗弧菌（V. anguillarum）与奥氏弧菌（V. ordalii），即不能对所有弧菌进行鉴定。dnaJ基因长约1150 bp，编码热休克蛋白40（HSP40），在不同细菌种内高度保守（Bustard and Gupta，1997；肖代雯等，2012），已被证实非常适用于分支杆菌属（Mycobacterium）、军团菌属（Legionella）和链球菌属（Streptococcus）的种间鉴定（Liu et al.，2003；Itoh et al.，2006）。dnaJ基因序列分析在区分和鉴定弧菌近缘种方面也表现出比16S rRNA、recA、rpoA和hsp60基因更明显的优势（Nhung et al.，2007）。【本研究切入点】dnaJ基因可作为弧菌种类鉴定的遗传进化分子标记，但目前仅扩增dnaJ基因的558 bp片段用于序列分析，以致于部分弧菌仍无法准确鉴定。因此，若能建立扩增弧菌dnaJ基因全长的PCR方法，必将有助于其种类的准确鉴定。【拟解决的关键问题】以弧菌dnaJ基因为靶基因，优化引物设计和PCR反应条件，拟建立一种能扩增dnaJ基因全长的PCR检测方法，为弧菌的快速筛查及种类鉴定提供技术支持。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

副溶血性弧菌ATCC 17802、哈氏弧菌ATCC 33868、创伤弧菌ATCC 27562、河流弧菌ATCC 33809、拟态弧菌ATCC 33653、霍乱弧菌NH87-21、沙门氏菌ATCC 14028、志贺氏菌CMCC（B）51252、金黄色葡萄球菌ATCC 6538、单增李斯特氏菌CVCC 1598和大肠埃希氏菌CMCC 44568等购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，溶藻弧菌ATCC 17749购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，副溶血性弧菌VP-FCG151118、哈氏弧菌VH-QZ160809、溶藻弧菌VA-QZ160809、創伤弧菌VV-BH160905、栖黑海弧菌Vp-BH160905、河流弧菌VF-FCG170910、致病性嗜水气单胞菌AH-TE090214、温和气单胞菌AS-NN090617、肺炎克雷伯菌KP-PX120222和无乳链球菌SA-NN130813由广西水产科学研究院水生动物疫病监控中心实验室保存提供；营养肉汤、3%氯化钠碱性蛋白胨水（APW）、血琼脂培养基、3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA）、3%氯化钠胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB）和硫代硫酸盐—柠檬酸盐—胆盐—蔗糖（TCBS）琼脂培养基购自北京陆桥技术有限责任公司；2×F8 FastLong PCR MasterMix（含DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、反应缓冲液）、细菌基因组DNA提取试剂盒、DL2000 DNA Marker和琼脂糖凝胶回收试剂盒购自北京艾德莱生物科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。检测样品包括32份海水样品（20份采自广西渔业环境常规监测海域，12份采自南美白对虾养殖池塘）和36份对虾样品（采自广西沿海对虾养殖场）。

1. 2 引物设计

从GenBank下载已公布的10种常见弧菌dnaJ基因全序列，采用MegAlign中的ClustalW进行同源性比对分析，以Primer Premier 5.0筛选结合Oligo 6.0评价，在dnaJ基因序列首尾的保守区域设计一对可扩增接近全长dnaJ基因的简并引物（上游引物XX-VF1：5'-GTGATTTTTACGAAGTATTAGGC-3'，下游引物XX-VR1：5'-GGTTAAATCRTCRAARAACTT-3'），预期片段大小1130 bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1. 3 菌种复苏及DNA提取

取冻存的各弧菌属菌株划线接种于TSA培养基上，（36±1）℃培养18～24 h后挑选单菌落接种于TSB培养基，（36±1）℃继续培养18～24 h。非弧菌属供试菌株则划线接种于血琼脂培养基上，（36±1）℃培养18～24 h后挑选单菌落接种于营养肉汤培养基中，（36±1）℃继续培养18～24 h。取上述菌液1.0～3.0 mL，10000 r/min离心1 min，弃上清液，收集菌体，按细菌基因组DNA提取试剂盒说明提取DNA。

1. 4 PCR反应条件优化

退火温度优化：参考引物合成时计算得到的Tm（上、下游引物分别为54.2和53.7 ℃），在50～60 ℃范围内设计退火温度梯度进行PCR扩增，筛选出最适退火温度。引物浓度优化：在最适退火温度下，将引物设为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9和1.0 μmol/L等10个浓度梯度进行PCR扩增，筛选出扩增效率高且无非特异性条带的最适引物浓度。

1. 5 特异性试验

采用优化后的PCR反应条件对弧菌属菌株及非弧菌属菌株进行PCR扩增检测，观察其特异性。

1. 6 灵敏度试验

以副溶血弧菌为例，取纯菌种接种于APW培养基上，培养至对数期；经TCBS平板计数确定原始浓度后用生理盐水进行10倍梯度稀释（108～10 CFU/mL），各梯度取1.0 mL菌液提取DNA并进行PCR扩增，以检测方法的灵敏度。

1. 7 临床应用评价

参照GB 4789.7—2013《食品安全国家标准 食品微生物学检验 副溶血性弧菌检验》对海水样品和对虾样品进行增菌培养，取25.0 mL海水样品或对虾样品25.0 g（成虾取肝胰腺和鳃/虾苗取整虾，匀浆或以剪刀尽量剪碎），加入225.0 mL APW，（36±1）℃培养8～18 h后以接种环沾取一环增菌液，划线接种于TCBS培养基上，（36±1）℃培养18～24 h；挑取优势菌落划线接种于TSA培养基上，（36±1）℃培养18～24 h；挑选纯培养的单个菌落接种于TSB培养基，（36±1）℃继续培养18～24 h；取1.0～3.0 mL菌液按1.3的方法提取DNA并进行PCR扩增，阳性扩增产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序，测序结果在GenBank中进行BLAST同源比对分析，确定菌种。同时，利用LaserGene中的MegAlign对上述所获弧菌序列进行同源性分析比对，采用MEGA 5.0构建系统发育进化树，评价dnaJ基因作为弧菌种类鉴定遗傳进化标记的适用性。

2 结果与分析

2. 1 PCR扩增反应条件

退火温度在50～60 ℃范围内均能扩增出对应的目的条带（图1），当退火温度高于57.2 ℃（泳道9～12）时，随退火温度的升高其扩增效果有所下降；退火温度为53.1～56.6 ℃（泳道4～8）时目的基因的扩增效率高且差异不明显，故选取55 ℃为PCR扩增程序的退火温度。比较不同引物浓度的PCR扩增效果（图2）发现，当引物终浓度低于0.7 μmol/L（泳道4）时，随引物浓度的降低其扩增效果呈下降趋势；引物终浓度为0.7～1.0 μmol/L（泳道1～4）时目的基因的扩增效率高且差异不明显，因此确定0.8 μmol/L为最适引物浓度。优化后的PCR反应体系50.0 μL：2×F8 FastLong PCR MasterMix 25.0 μL，上、下游引物（20 μmol/L）各2.0 μL，DNA模板5.0 μL，灭菌水补足至50.0 μL。扩增程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，进行35个循环；最后72 ℃延伸5 min。

2. 2 PCR检测方法的特异性

采用优化后的PCR反应条件对副溶血性弧菌、哈氏弧菌、创伤弧菌、河流弧菌、溶藻弧菌、拟态弧菌、霍乱弧菌和栖黑海弧菌等8种弧菌属细菌（共13株）及沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特氏菌、大肠埃希氏菌、致病性嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、肺炎克雷伯菌和无乳链球菌等9株非弧菌属细菌进行PCR扩增检测，结果（图3）显示，13株（泳道1～13）弧菌均可扩增出1130 bp的目的带，而9株（泳道14～22）非弧菌属菌株未扩增出任何条带，表明建立的弧菌PCR检测方法具有很强的特异性。

2. 3 PCR检测方法的灵敏性

由图4可看出，当菌悬液浓度≥102 CFU/mL（泳道1～7）时，PCR扩增电泳结果均可见预期的目的条带；但菌悬液稀释至10 CFU/mL时，经PCR扩增后未出现任何条带。说明该PCR检测方法对弧菌的最低检出限为102 CFU/mL。

2. 4 临床应用效果

32份海水样品均能分离获得弧菌，共51株，提取各分离菌株的DNA进行dnaJ基因PCR检测，结果显示全部为阳性；阳性PCR扩增产物经测序后进行BLAST同源比对分析，结果表明，从海水样品中分离获得的51株弧菌有5株为副溶血弧菌、16株为溶藻弧菌、12株为创伤弧菌、9株为河流弧菌、6株为哈氏弧菌、3株为栖黑海弧菌。36份对虾样品中有23份样品分离出弧菌，共32株，提取各分离菌株的DNA进行dnaJ基因PCR检测，结果显示全部为阳性；阳性PCR扩增产物经测序后进行BLAST同源比对分析，结果发现从对虾分离获得的32株弧菌有9株为副溶血弧菌、11株为溶藻弧菌、2株为创伤弧菌、3株为河流弧菌、7株为哈氏弧菌。对上述83株弧菌的dnaJ基因序列进行同源性比对分析并构建系统发育进化树，结果显示，种间菌株的dnaJ基因序列相似度为79.5%～92.8%，种内菌株间的dnaJ基因序列相似度为98.2%～99.9%；从基于dnaJ基因构建的系统发育进化树（图5）也可看出，同种类的弧菌均聚为一个分支，种类区分清晰。

3 讨论

弧菌是海水环境普遍存在的菌群之一，也是海水养殖中最常见的一种条件致病菌。海水养殖规模的不断扩大导致水产动物赖以生存的生态环境不断恶化，细菌性疾病的发生和流行越来越严重，如近年来养殖凡纳滨对虾常暴发的急性肝胰腺坏死病（AHPND）、早期死亡综合征和红体病等重大流行性疾病，且调查发现这些疾病与对虾体内常携带大量弧菌高度相关（陈健舜等，2012；文国樑，2015；徐含颖等，2015），说明弧菌已成为对虾养殖过程中危害最严重的致病菌。鉴于弧菌的危害性，其检测方法不断更新发展，生理生化鉴定、PCR、环介导恒温扩增（LAMP）、交叉引物恒温扩增（CPA）、细菌多位点序列分型（MLST）及基因芯片等技术均被应用于弧菌的检测与鉴定（秦瑞等，2016；殷红秋等，2016；毕水莲等，2017）；但这些鉴定方法均是针对特定的已知弧菌，对罕见或未知菌种难以鉴定，因此迫切需要一种能快速检测并可鉴定种类的弧菌通用检测方法。

dnaJ基因为弧菌属细菌所共有，且在不同弧菌种内高度保守，因此建立一种基于dnaJ基因的弧菌PCR检测方法，并结合测序技术，即可实现对弧菌属细菌的快速检测及种类鉴定。本研究以dnaJ基因为靶基因，在其首尾的保守区域设计一对简并引物，通过优化退火温度和引物浓度，成功建立了能扩增弧菌接近全长dnaJ基因的PCR检测方法。该方法对弧菌属细菌具有很强的特异性，其检测灵敏度下限为102 CFU/mL。此外，本研究采用PCR快速扩增预混液，其快速的变性、退火及延伸速度可将PCR检测时间缩短至1 h左右。应用该方法对51株分离自海水样品的弧菌和32株分离自对虾样品的弧菌进行检测，结果显示全部为阳性；经测序及同源性比对分析发现，种间菌株的dnaJ基因序列相似度为79.5%～92.8%，种内菌株间的dnaJ基因序列相似度为98.2%～99.9%，说明本研究建立的PCR检测方法对海水环境、海水养殖水体及养殖动物体内的弧菌检测均具有良好适用性，同时可准确鉴定弧菌种类。

近几年，以AHPND为首的对虾病害肆虐各对虾养殖区域，流行范围遍及全国沿海所有对虾主产区，已引起业界广泛关注。已有研究表明，副溶血弧菌、哈维氏弧菌和坎贝氏弧菌等多种弧菌均可导致AHPND发生（刘志轩，2017）。本研究对36份对虾样品进行弧菌分离，结果从23份样品中分离得到包括副溶血性弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌、河流弧菌和哈氏弧菌在内的5种弧菌共32株，说明广西养殖对虾体内携带弧菌的现象非常普遍。正确诊断是有效防治疾病的前提，虽然弧菌的存在不一定会致病，但了解养殖水体及对虾体内弧菌的种类可为弧菌病的预警和防控提供参考。本研究基于dnaJ基因建立的弧菌PCR检测方法能扩增出弧菌接近全长dnaJ基因，结合测序技术，可为弧菌快速筛查及种类鉴定提供更全面和更准确的技术手段。

4 结论

基于dnaJ基因建立的弧菌PCR检测方法能扩增出弧菌接近全长dnaJ基因，具有快速便捷、灵敏准确、适应性好等优点，结合测序技术，可为弧菌快速筛查及种类鉴定提供更全面和更准确的技术手段。

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（責任编辑 兰宗宝）