新型鸡粪发酵提取液对番茄生长及根结线虫病的影响

王虹云　李涛　姚建刚　张丽莉　周杨　董泰丽　付传翠　夏秀波　曹守军

摘要：【目的】研究雞粪发酵提取液对番茄生长及根结线虫病防治效果的影响，为科学利用鸡粪防治作物根结线虫病提供参考。【方法】设5、10、25、50、100、300、500和1000倍8个稀释倍数的鸡粪发酵提取液处理，以清水为对照，通过浇灌已接种南方根结线虫的盆栽番茄，研究其对番茄植株生长及根结线虫病防治效果的影响；通过室内培养2龄根结线虫和根结线虫卵，研究不同稀释倍数的鸡粪发酵提取液对根结线虫致死和根结线虫卵孵化的影响。【结果】50、100和300倍鸡粪发酵稀释液更有利于番茄植株前期生长；5、10和25倍鸡粪发酵稀释液更有利于番茄植株后期生长，且能显著降低根结线虫发病率，最高防效达72.7%。培养试验结果表明，5、10和25倍鸡粪发酵稀释液能显著抑制根结线虫卵孵化，抑制率在70.0%以上；5和10倍鸡粪发酵稀释液对根结线虫的致死作用明显，处理后24 h即达到100.0%的致死效果。【结论】5～10倍稀释的新型鸡粪发酵提取液能促进番茄植株生长，显著抑制根结线虫卵的孵化，杀死2龄线虫，减少根结线虫病的发生，是一种操作简便且环保安全的根结线虫病防治方法。

关键词： 鸡粪发酵液；番茄；根结线虫；生长；防治效果

中图分类号： S432.45 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）06-1130-09

Abstract：【Objective】The effects of chicken manure fermented extract on the tomato growth and control efficiency of root knot nematode were studied to provide reference for scientific use of chicken manure to control root knot nematode. 【Method】Eight diluted multiples（5， 10， 25， 50， 100， 300， 500 and 1000 times） of chicken manure fermented extract were used. Clear water was taken as control. Their effects on growth of tomato plants and the control efficiency of root knot nematode were studied by irrigation of the potted tomatoes inoculated with root knot nematodes. The second instar root knot nematode and root knot nematode eggs were cultured indoor to study the effects of different dilutions of chicken manure fermented extract on lethality of root knot nematode and hatching of its eggs. 【Result】The pot experiment results showed that 50， 100 and 300 times of chicken manure fermented liquid could promote the growth of tomato plants at early stage. High concentration（diluted 5， 10 and 25 times） of chicken manure fermented liquid could enhance the growth of plants at late stage and decrease incidence of root knot nematode with the highest control efficiency of 72.7%. The culture experiment results showed that high concentration（diluted 5， 10 and 25 times） of chicken manure fermented diluent could significantly reduce the hatchability of root knot nematode eggs with inhibition rate of 70.0%. Above all， 5 and 10 times dilution of chicken manure fermented extract caused obvious lethality to root knot nematodes， with a lethal effect of 100.0% 24 h after treatment. 【Conclusion】5-10 times of chicken manure fermented diluent can promote the growth of the tomato plant， plays an important role in inhibiting the hatching of the eggs and killing the second instar juvenile and reduce the incidence of root knot nematode. It is a simple and safe method to prevent and control root knot nematode disease.

Key words： chicken manure fermented extract； tomato； root knot nematode； growth； control efficiency

0 引言

【研究意义】根结线虫（Meloidogyne spp.）可寄生于多种农作物的根系，其分布范围广，是严重危害农业生产的一种土传病害。该病害发生后，植物受害严重，一般减产10%左右，严重的高达75%以上，甚至绝产（Oka et al.， 2000）。目前根结线虫的防治方法较多，主要包括物理方法、化学方法、生物方法及将几种方法联合起来的综合防治策略。鉴于化学方法见效快，生产中历来以化学杀线剂为主，但其对环境污染严重，破坏生态平衡，且农药残留极大地降低了农产品质量，不利于农业的可持续发展，故研制开发环保安全型防治根结线虫病的方法具有重要意义。另外，鸡粪作为畜禽排泄废弃物进行发酵重复利用，可为禽粪的无害化应用提供了有效途径。【前人研究进展】由于对蔬菜品质、土壤生态系统及环境保护的日益重视，根结线虫病逐步趋向于应用非化学方法进行治理。施入拮抗菌生物有机肥较无机肥能显著降低植物根结线虫病的发病率（陈芳等，2011；朱震等，2011）；马玉琴等（2016）研究发现，不同配比的交枝頂孢霉、木霉、淡紫拟青霉和芽孢杆菌通过菌株间的协同作用，能显著减退根结线虫的发生，减少根结的生成，促进植株生长。但生防菌均存在防治效果不稳定、成本价格较高等问题，且外源微生物及菌种的引入存在破坏土壤生态的危险。近年来，农业防治根结线虫病的方法被大量应用。已有研究发现，与分蘖洋葱（杨阳和吴凤芝，2011）及禾本科植物（杨瑞娟等，2017）套作可降低作物植株根结线虫病的病情指数，改善土壤微环境，提高产量；植物残体如小麦秸秆（曹志平等，2010）、绿肥紫堇科植物（Naz et al.， 2015）及大蒜秸秆（巩彪等，2016）的施入在一定程度上优化了温室连作土壤微生物环境，提高了微生物的数量及多样性，从而控制了根结线虫的繁殖；高淋淋等（2016）以水稻秸秆、香蕉茎叶和平菇培养肥料等为试材，研究不同堆肥提取液和发酵液不同稀释倍数对番茄根结线虫的防治效果，结果发现各堆肥提取液和发酵液对番茄根结线虫均有一定的防治作用，最高防效达74.19%。鸡粪较其他畜禽粪便养分含量更丰富，生产中常用作有机肥（甘丽红等，2016；刘术新等，2016）。郭玉莲（2004）研究表明鸡粪可明显降低根结数，且随鸡粪处理时间的延长，抑制效果相应提高。但不合理施用鸡粪肥会直接影响植株的生长，包括植株心叶发黄、矮化、根系蜷缩畸形或无花无果，以及烧根、烧苗、熏棵、死株等，同时会引起病毒病、疫病、茎基腐病、根腐病和青枯病等病害（李国良等，2010）。鸡粪经无害化处理和腐熟发酵等过程后，可杀死大部分病原菌和虫卵，减少烧根、烂苗等现象的发生。【本研究切入点】目前，有关鸡粪发酵液防治作物根结线虫病的研究尚无文献报道。【拟解决的关键问题】利用鸡粪经生物发酵工艺，通过U-NRO多级透析提纯获得稳定的发酵液，研究其对番茄生长及根结线虫病防治效果的影响，并探讨其作用方式，旨在为科学利用鸡粪防治作物根结线虫病提供参考依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

试验于2017年在烟台市农业科学研究院蔬菜温室内进行，3月8日育苗，4月19日盆栽定植，4月24日接种线虫，6月24日结束试验。

供试番茄（Solanum lycopersicum）品种为烟台市农业科学研究院蔬菜研究所选育的烟粉207。供试根结线虫2龄幼虫的获得：挑选温室大棚内受根结线虫为害严重的番茄植株，取发病重根系，以自来水洗净，用镊子挑取根系上附着的卵块，用1% NaClO表面消解1 min，无菌水冲洗5～6次，置于铺有纱网的培养皿中，加水置于25 ℃培养箱，7 d左右取纱网下层的J2悬浮液，约6000条/mL，经鉴定为南方根结线虫，用于接种试验。供试根结线虫卵的获取：卵块的获取同上，轻轻研磨后，配制成卵悬液，约5000个/mL，用于卵孵化试验。鸡粪发酵提取液由山东民和生物科技股份有限公司提供，是鸡粪经生物发酵工艺并通过U-NRO多级透析提纯获得的稳定发酵液。

1. 2 试验方法

番茄种子正常催芽育苗，待长至3叶1心时移入装有草炭土的试验盆中（高15 cm×直径18 cm），每盆1株，缓苗5 d后接种根结线虫。参照徐小明等（2008）的方法接种线虫，接种量为3000条/株，对照组以相同方式注入同体积的清水。接种完成后向土壤表面喷洒适量清水，以保持土壤湿润。

接种线虫3 d后进行不同浓度鸡粪发酵液对番茄生长的影响试验。试验设计：将鸡粪发酵液分别稀释5、10、25、50、100、300、500和1000倍，以接种线虫、施清水为对照（CK），共9个处理，每处理5株番茄，3次重复。视情况每2 d浇一次水，每10 d浇一次鸡粪发酵液（共浇6次），每次300 mL。

1. 3 测定指标及方法

分别于处理后30（5月24日）和60 d（6月24日），采用常规方法测定番茄株高、茎粗、根长、根鲜重和地上部鲜重；气孔导度（Gs）、净光合速率（Pn）、胞间CO2浓度（Ci）和蒸腾速率（Tr）采用LI-6400XT便携式光合仪（美国LI-COR公司）在晴天上午10：00左右选取番茄生长点向下第3片功能叶进行测定。

1. 4 根结线虫病害调查方法

分别于处理后30和60 d根据病害症状对各处理番茄的根部发病情况进行调查，记录病情级别。根结分级标准参照马玉琴等（2016），0 级：根系健康，无根结；1级：有极少量根结，根结数量占全根系的1%～20%；2级：有少量根结，根结数量占全根系的21%～40%；3级：根结量中等，根结数量占全根系的41%～60%；4级：根结量很多，根结数量占全根系的61%～80%；5级：根结量极多且大，根结数量占全根系的81%～100%。计算病情指数，确定防治效果。

病情指数（%）=[（各级病株数×相应级别数）总株数×最高病情指数]

×100

防治效果（%）=[对照病情指数-处理病情指数对照病情指数]

×100

1. 5 根结次氯酸钠—酸性品红染色

参照Fan等（2015）的方法，略有改动。将洗净的番茄根系置于1.5%次氯酸钠溶液中浸泡4 min，取出用自来水冲洗30 s后转入蒸馏水中浸泡15 min以去除残留的次氯酸钠。将根系转入3%酸性品红溶液，煮沸1 min，冷却后用自来水冲洗根系表面的残留品红，转移酸性甘油（甘油中加2～3滴5 mol/L HCl）的烧杯中加热褪色0.5～1.0 h，最后将根系转入甘油∶乳酸∶蒸馏水（1∶1∶1）中，过夜后根褪色即可见根结处红色较深，此时可对根上的根结数进行统计。

1. 6 鸡粪发酵液对根结线虫卵孵化率的影响

利用96孔板，每孔分别加入根结线虫卵悬液40 μL（约200个）及不同体积鸡粪发酵提取原液，用无菌水补充至总体积300 μL，使鸡粪发酵液稀释倍数分别为5、10、25、50、100、300、500和1000倍，以无菌水为对照（CK），置于25 ℃培养箱中培养，每隔2～3 d观察虫卵孵化状况，记录根结线虫孵化数，计算虫卵孵化率。每处理重复5次。由于高浓度发酵液（稀释5、10和25倍）为灰黑色影响观察，试验取各孔内15 μL混合物于载玻片上进行显微观察，各孔重复3次。

1. 7 鸡粪发酵液对根结线虫2龄幼虫存活的影响

利用96孔板，每孔分别加入根结线虫悬液20 μL（100条左右）及不同体积鸡粪发酵提取原液，用无菌水补充至总体积300 μL，使鸡粪发酵液稀释倍数分别为5、10、25、50、100、300、500和1000倍，以无菌水为对照（CK），置于25 ℃培养箱中培养，培养后8、24和48 h分别观察线虫存活情况。每处理5个重复。高浓度观察方法同上。记录线虫死亡数目（线虫僵直，针刺不动视为死亡），计算2龄幼虫死亡率。

1. 8 统计分析

采用Excel 2003对数据进行整理，运用DPS 7.05对数据进行分析及差异显著性检验。

2 结果与分析

2. 1 鸡粪发酵提取液对番茄生长及光合作用的影响

由图1和表1可知，经不同稀释倍数鸡粪发酵提取液处理30 d后，5和10倍稀释提取液处理的番茄植株叶片浓密深绿，株高和茎粗显著低于对照（P<0.05，下同），根鲜重显著高于对照，地上部鲜重与对照差异不显著（P>0.05，下同），根冠比显著高于其他处理，说明5和10倍稀释液能显著促进番茄地下部根系生长；25、50、100和300倍稀释处理，番茄的株高与对照差异不显著，地上部及根鲜重显著高于对照，植株长势壮；500和1000倍稀释处理番茄株高显著高于其他处理，除500倍稀释处理茎粗和根冠比显著低于对照外，其他生长指标与对照差异不显著。处理60 d后，各处理番茄植株株高与对照差异不显著，5、10和25倍稀释处理植株长势强，叶大、深绿，地上部鲜重与50倍稀释处理差异不显著，但显著高于其他处理，根鲜重高于对照，根冠比减小，说明前期根系的良好生长促进了后期地上部茎叶的生长。

由表2可看出，经不同稀释倍数鸡粪发酵提取液处理30 d后，5、10和25倍稀释处理的Pn较低，而50、100、300和500倍稀释处理的番茄Pn较高，综合比较，处理组各光合指标与对照差异均不显著。处理60 d后，5、10和25倍稀释处理的Pn增强，高于其他各处理，且显著高于对照。另外，除25倍及500倍稀释处理的Gs、Tr和Ci显著高于对照外，处理组各指标与对照差异均不显著。综上所述，50～300倍稀释液更有利于番茄植株前期的生长，随植株营养需求量变大，后期5～25倍稀释液更有利于番茄植株的生长。

2. 2 鸡粪发酵提取液对番茄根结线虫病的防治效果

处理30和60 d后，将各处理番茄根系用清水冲洗干净，对根部发病情况进行调查，记录病情级别。分析发现（表3），与对照相比，5～300倍稀释液在一定程度上能减轻番茄植株根结线虫病的发生，且随鸡粪发酵液浓度的增加，防治效果逐渐增强。其中，5和10倍鸡粪发酵稀释液能显著降低根结线虫的危害，前期（30 d）病情指数均为20.0%，防治效果为57.1%，60 d后病情指数分别为20.0%和26.7%，防治效果为72.7%和63.6%，有效减少了根结线虫对番茄根系的侵染；25倍稀释液在一定程度上也能减轻根结线虫的发生，处理后30 d的病情指数为26.7%，防治效果为42.8%，60 d病情指数为46.7%，防治效果为36.4%；50～300倍稀释处理的病情指数较高，防治效果低于30.0%；500和1000倍稀释处理的病情指数均高于对照。

由图2可看出，较对照组植株，5～300倍鸡粪发酵稀释液处理能显著促进番茄根系生长，须根明显增多，根系发达。对根结的观察发现，对照及低濃度鸡粪发酵液处理的植株根系根结大且多成串状，高浓度5和10倍稀释处理的根系则恰好相反，根结小而少。

2. 3 鸡粪发酵提取液对根结线虫及其卵孵化的影响

进一步研究鸡粪发酵提取液对根结线虫卵孵化的影响及对线虫的致死效果。结果（图3、图4）发现，与对照相比，鸡粪发酵提取液稀释5、10和25倍处理能显著抑制根结线虫卵的孵化，抑制率在70.0%以上；稀释50、100和300倍在处理前期能明显抑制根结线虫的孵化，且稀释倍数越小，抑制效果越明显，但这种抑制只是推迟其孵化时间，对最终线虫的孵化率无明显影响；对照根结线虫孵化的倍数增长期出现在4～15 d，50、100和300倍稀释处理的倍数增长期出现延迟，推迟至7 d后；500和1000倍稀释处理对根结线虫卵孵化的影响不显著。

不同稀释倍数鸡粪发酵提取液对根结线虫致死效果的试验结果（图5、图6）表明，5和10倍鸡粪发酵稀释液对根结线虫的致死作用明显，24 h时均达到100.0%的致死效果；25倍稀释液在处理48 h时致死效果也能达到70.0%以上，50倍稀释液处理48 h时致死效果在20.0%左右。

3 讨论

本研究结果显示，施用5～300倍鸡粪发酵稀释液后均能促进番茄植株生长，其中50、100和300倍稀释液能显著提高番茄地上部及根鲜重，促进番茄植株前期生长，植株长势壮；5、10和25倍稀释液对番茄植株前期地上部生长促进效果不明显，但能显著促进根系生长，使须根发生量增多，在番茄生长中后期作用效果开始显现，植株Pn显著提高，生长势增强，与鸡粪发酵提取液施用后促进根系生长，从而为中后期旺盛生长打下了基础有关，与甘丽红等（2016）的研究结果一致。

鸡粪发酵提取液对根结线虫病的抑制效果具有明显的浓度效应，稀释倍数越小，效果越明显。5和10倍稀释液的施入能显著降低番茄根结线虫病的发生，但施用低浓度的鸡粪发酵液（500和1000倍稀释）根结线虫病情指数较对照显著升高，可能是由于低浓度的鸡粪发酵液含有较少的线虫毒害物质，且该土壤环境更有利于线虫的生长繁殖，从而导致病害的加重，具体原因尚需进一步研究。因此，在实际生产中应严格控制鸡粪发酵液的施用浓度。

培养试验中发现5、10和25倍鸡粪发酵稀释液对根结线虫均有一定的致死效果，且能显著抑制根结线虫卵的孵化，说明鸡粪发酵液中含有导致根结线虫死亡及抑制卵孵化的物质。目前，从植物资源中分离杀线物质防治根结线虫的研究较广泛，并取得了较好的效果，如从万寿菊属植物分离得到的三联噻吩类化合物（Natarajan et al.， 2006），从苦楝中分离得到的苦楝素（Javed et al.， 2008），一些十字花科植物产生的葡糖异硫氰酸盐化合物（Monfort et al.， 2007）等均对根结线虫有较好的杀灭效果，但针对发酵有机肥中防治根结线虫主要物质的研究还较少。今后将进一步研究鸡粪发酵液的主要组成成分，确定杀线的有效物质，以期为根结线虫病的防治提供新的途径。

4 结论

在番茄生长过程中施入5～10倍稀释的新型鸡粪发酵提取液能促进番茄植株生长，显著抑制根结线虫卵孵化，杀死2龄线虫，减少根结线虫病的发生，最高防效可达72.7%，是一种操作简便且环保安全的根结线虫病防治方法。

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（責任编辑 麻小燕）