九香虫及其伪品小皱蝽对人胃癌SGC-7901细胞的增殖抑制比较

吴有芳 曹米兰 檀军 郭建军

摘要：小皱蝽为九香虫的伪品，市场上常被作为九香虫销售。本实验旨在用MTT法检测九香虫和小皱蝽血淋巴对人胃癌SGC-7901细胞的增长抑制作用，比较二者对人胃癌SGC-7901细胞的体外增殖抑制作用。用九香虫和小皱蝽血淋巴分别作用于体外培养的SGC-7901细胞，测定其抑制率。结果表明，九香虫和小皱蝽对SGC-7901细胞皆有抑制作用，且抑制率随时间和浓度的增加而增加;相同浓度不同时间（24 h、48 h、72 h）和相同时间不同浓度（100 mg/L、200 mg/L、300 mg/L、400 mg/L）小皱蝽对SGC-7901细胞的抑制率皆高于九香虫。

关键词：九香虫;小皱蝽;人胃癌细胞SGC-7901细胞;抑制率;MTT法

Comparison of the Inhibitory Effects between Aspongopus chinensis and Cyclopelta parva on Proliferation of Human Gastric Cancer Cell SGC-7901

WU You fang，CAO Mi lan，TAN Jun， GUO Jian jun*

（Institute of Entomology， Guizhou  Provincial Key Laboratory for Agricultural Pest Management of Mountainous Region， Guizhou University， Guiyang， Guizhou 550025， China）

Abstract：Cyclopelta parva is a counterfeit species of Aspongopus chinensis， which usually be sold as A. chinensis in the market. This paper  aimed to clarify the inhibitory effect of C. parva on the proliferation of human gastric cancer SGC-7901 cells in vitro by comparing their inhibitory effects on human gastric cancer cell SGC-7901 with A. chinensis by MTT method. The results demonstrated that the inhibition rates of SGC-7901 treated by A. chinensis and C. parva heamolymph both increased with times and concentrations. C. parva haemolymph had higher inhibitory effects on SGC-7901 than A. chinensis regardless of the same concentration with different times or different concentrations with the same time.

Key words：Aspongopus chinensis; Cyclopelta parva; SGC 7901; inhibition rate; MTT method

九香蟲Aspongopus chinensis Dallas，1851隶属于昆虫纲Insecta半翅目Hemiptera兜蝽科Dinidoridae[1]，是传统的药用资源昆虫，主治膈脘滞气、脾肾亏损、壮元阳、胃寒胀、腰膝酸痛[2-3]。现代药理学研究表明九香虫对胃癌、乳腺癌均有一定的疗效，以九香虫为原料的一些中成药，如复方香龙散、九香抗癌定痛散等对抑制癌细胞都有一定的作用。九香虫血淋巴提取物对胃癌和乳腺癌体外细胞增殖具有一定的抑制作用[4-6]。小皱蝽Cyclopelta parva Distant隶属于昆虫纲Insecta半翅目Hemiptera蝽科Pentatomidae[7]。小皱蝽和九香虫外形较为相似，在市场上常被当成九香虫广泛出售，又被称为“小九香虫”。但是其是否具有抑制胃癌细胞增殖的功效尚不清楚。目前国内外还未出现过与小皱蝽抑制癌细胞相关的研究报道。所以本实验研究小皱蝽和九香虫对胃癌细胞的抑制作用比较，明确小皱蝽是否具有抑制胃癌细胞的作用及与九香虫的差异。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1供试虫源

九香虫成虫采集自贵州省习水县习酒镇河滩上，习酒镇地处北纬28°09′，东经106°10′。

小皱蝽成虫采集自贵州省贵阳市花溪区田园北路刺槐，花溪区地处北纬26°11′～26°34′，东经106°27′～106°52′。

上述采集获得的活虫置于-80℃冰箱（美国Thermo公司）冷冻备用。

1.1.2主要试剂

DMEM高糖培养基（美国HyClone公司），二辛可酸（BCA）蛋白浓度测定试剂盒（北京康为世纪公司），二甲基亚砜（DMSO，美国Amresco公司），胰蛋白酶（美国赛默飞世尔科技有限公司），噻唑蓝（MTT，美国Sigma公司）。

1.2方法

1.2.1九香虫和小皱蝽血淋巴制备

九香虫和小皱蝽血淋巴制备参照杨佳琪等 [6] 的方法。

1.2.2九香虫和小皱蝽蛋白浓度测定

利用BCA法测定九香虫和小皱蝽的蛋白浓度。参照BCA蛋白定量试剂盒说明书制作标准曲线，将九香虫和小皱蝽的血淋巴稀释100倍加入酶标孔板中，每孔25 μL，设置三个重复孔，每孔加入200 μL已配制好的BCA工作液。放入37℃环境下，孵育30 min。冷却至室温，在562 nm波长检测吸光度（OD）值。根据标准曲线计算九香虫和小皱蝽总蛋白浓度。

1.2.3SGC-7901细胞培养

人胃癌SGC-7901细胞购自中科院上海细胞库，用含10%胎牛血清，1%双抗的DMEM高糖培养基于37℃，5%CO2的细胞培养箱（美国Thermo公司）中培养，取对数生长期的细胞进行实验。

1.2.4MMT法检测九香虫和小皱蝽对SGC-7901细胞的抑制率

实验设有实验组，无药对照组和空白对照组。

将培养到对数期的SGC-7901细胞用0.25%的胰酶消化，用DMEM培养液稀释，使细胞密度达到1×105个/mL，接种于96孔板中，每孔200 μL，接种3块96孔板。置于37℃，5%CO2的细胞培养箱中培养。待细胞贴壁后，吸尽原培养液，分别加入含100 mg/L，200 mg/L，300 mg/L，400 mg/L九香虫和小皱蝽血淋巴的DMEM培养液，对照组加入不含血淋巴的DMEM培养液;每个处理5个复孔。置于37℃，5%CO2的培养箱中培养，分别于24 h，48 h，72 h后各取出1块96孔板，每孔加入MTT溶液20 μL，继续培养4 h后，吸去培养液，每孔加入150 μL DMSO，摇床震荡20 min，待紫色结晶完全溶解后在570 nm波长下，用酶标仪检测吸光度（OD）值。

计算细胞增殖抑制率：

抑制率=[1-（实验组OD值-空白组OD值）/（无药对照组OD值-空白对照组OD值）]×100%

1.3数据处理

实验数据应用SPSS 19.0软件进行单因素方差ANOVA分析。试验数据以平均数±标准误（x±s）表示，以P<0.05为差异有统计学意义;采用Excel软件绘图。

2结果与分析

2.1BCA法测定九香虫和小皱蝽蛋白含量

应用BCA法测得各浓度标准牛血清蛋白吸光度值，计算平均值（表1）。

以吸光度为横坐标（X），浓度为纵坐标（Y）进行线性回归分析，得到蛋白质的标准线（图1）：Y=0.9609X-0.0607，R2=0.9887。

根据标准曲线和测得的九香虫和小皱蝽血淋巴稀释液的吸光度值计算蛋白质浓度，得到小皱蝽血淋巴液蛋白浓度比九香虫血淋巴液的蛋白浓度低（见表2）。

2.2九香虫和小皱蝽血淋巴对SGC-7901细胞抑制率的比较

根据BCA蛋白测定法确定的九香虫和小皱蝽血淋巴的蛋白含量，计算用于SGC-7901细胞的九香虫和小皱蝽的血淋巴浓度分别为100 mg/L、200 mg/L、300 mg/L、400 mg/L。MTT法检测结果（见表3），血淋巴处理24 h、48 h、72 h后，九香虫和小皱蝽对SGC-7901细胞增殖都有明显抑制作用。相同时间不同浓度下九香虫和小皱蝽血淋巴对SGC-7901细胞的抑制率与无药对照组比较，有显著差异（P<0.05）。相同时间不同浓度下九香虫和小皱蝽对SGC-7901细胞抑制率比较，有显著差异（P<0.05）。

实验结果显示（图2），相同时间不同浓度下，九香虫和小皱蝽血淋巴对SGC-7901细胞的抑制率随浓度的增加而增加，且小皱蝽血淋巴对SGC-7901的抑制作用比九香虫血淋巴的明显。相同浓度不同时间下，九香虫和小皱蝽血淋巴对SGC-7901细胞的抑制率随时间的增加而增加。处理SGC-7901细胞24 h后，在试验的任何浓度下，小皱蝽血淋巴对SGC-7901细胞的抑制作用比九香虫血淋巴明显，最高抑制率为400 mg/L时，抑制率达到64.13%。处理48 h后，小皱蝽对SGC-7901细胞的抑制作用在实验的任何浓度下同样比九香虫高，抑制率最高是400 mg/L时，小皱蝽为91.44%，九香虫为80.48%。血淋巴处理72 h后，小皱蝽血淋巴对SGC-7901细胞的抑制作用同样比九香虫好，在400 mg/L时，抑制率最高，达到了99.06%。处理72 h后，九香虫和小皱蝽血淋巴对SGC-7901的抑制率都比较高，但相同浓度下，小皱蝽对SGC-7901的抑制率同样高于九香虫。

3结论与讨论

九香虫作为传统药用昆虫，除了本草纲目中有所记载，在《动物药》也载录了九香虫可与多种中药治疗肝胃气痛、十二指肠溃疡、胃炎和血管瘤等多种疾病[8]，且九香虫的蛋白提取物对SGC-7901细胞有明显的增殖抑制作用[9]。并在临床上得到应用，具有重要的药用价值。在市场上小皱蝽常作為九香虫售卖，但对于小皱蝽药用价值研究报道的比较少。目前，国内外还没有对小皱蝽抗癌方面的研究进行报道。所以研究探讨小皱蝽是否具有抗癌活性以及其抗癌活性的高低对开发有药用价值的昆虫，发掘更多抗肿瘤药用昆虫有着重要的意义。

本研究显示，九香虫对SGC-7901细胞的抑制作用随时间和浓度的增加而增加，有较好抑制体外SGC-7901细胞增殖的作用，这与檀军等 [5] 的研究结果一致。小皱蝽虽然作为九香虫伪品，但其血淋巴对人胃癌SGC-7901细胞有明显的抑制作用。在用九香虫和小皱蝽血淋巴分别作用SGC-7901细胞24 h和48 h后，小皱蝽对SGC-7901细胞的增殖抑制作用明显高于九香虫;特别是处理24 h后，小皱蝽对SGC-7901细胞的抑制作用显著高于九香虫;在处理72 h后，小皱蝽和九香虫对SGC-7901细胞的增殖都有较明显的抑制作用，但小皱蝽对SGC-7901细胞的抑制率依然高于九香虫。小皱蝽与九香虫对SGC-7901细胞增殖抑制差异可能是九香虫和小皱蝽的作用物质或作用机制不同导致小皱蝽在较短的时间就对SGC-7901细胞有比九香虫高的抑制率;这还需要进一步进行研究验证。从本研究可以确定的是小皱蝽对SGC-7901细胞的增殖抑制作用高于九香虫。

小皱蝽前期研究也已证明其具有良好的抗菌活性[10-11];该结果与九香虫前期研究相吻合[12]。因而初步推测小皱蝽和九香虫相似，都可以作为药用资源昆虫，且具有类似的抗菌、消炎、诱导癌细胞凋亡及增强机体免疫力功效。

尽管小皱蝽已经明确其具有类似九香虫的药物功效，但是九香虫的活性物质已经初步明确为功能多肽（实验室发表中），作用途径为内源线粒体凋亡途径[13]。小皱蝽的抑制癌细胞活性物质、作用途径、作用机制等是否和九香虫一致或类似，仍未可知，仍需进一步明确。并且除了对小皱蝽抗菌活性和抑制癌细胞增殖的作用有过研究，其他领域还没有过多的研究，因此还需要对小皱蝽进行更多方面的研究来确定其是否真的如九香虫一样具有良好的药用价值。因而小皱蝽作为九香虫替代品的合理性也仍需进一步研究和探讨。

相信上述问题的明确可以为小皱蝽这一新提出的药用资源昆虫[7]的开发利用奠定坚实的应用基础。

参考文献：

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[5]檀军，郭建军，魏超，等. 九香虫血淋巴对胃癌SGC-7901细胞体外增殖的抑制作用[J].山地农业生物学报，2013，32（2）： 119-122.

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[11]杨泽宏，杨星勇，罗克明，等. 小皱蝽抗菌物质的诱导及抗菌肽AMP-2的分离纯化和特性[J].应用与环境昆虫学报，2006，12（2）： 210-214.

[12]吴玛莉，金道超，九香虫血淋巴及其纯化蛋白抑菌活性的研究[J].昆虫知识，2005，42（3）： 315-318.

[13]杨佳琪，郭建军，龙金麟，等. 九香虫血淋巴对肿瘤细胞凋亡相关蛋白表达的影响[J].生物资源，2017b，39（5）： 360-365.