低温胁迫下油棕WRKY转录因子基因的表达特性分析

周丽霞 曹红星

摘要：【目的】研究低温胁迫下WRKY转录因子基因表达特性，并分析其与油棕抗寒性的相关性，为阐明WRKY转录因子在油棕生长和低温响应机制中的功能和作用提供理论参考。【方法】以油棕品种XJS30和SJ64为材料，对其进行低温驯化处理（0 h、1 d和7 d）及冷处理（10 ℃ 4 h、8 ℃ 4 h、6 ℃ 4 h、4 ℃ 4 h和2 ℃ 4 h），利用实时荧光定量PCR（qPCR）检测不同处理时间的WRKY1、WRKY7、WRKY22、WRKY40和WRKY55基因表达特性，并分析其与油棕抗寒性的相关性。【结果】WRKY1和WRKY7基因在低温驯化结束时的表达量较冷处理结束时高，说明其在低温驯化过程中对XJS30的抗寒性构成发挥调控作用。WRKY22、WRKY40和WRKY55基因均在XJS30冷处理中表达量最高，说明其在冷处理过程中对XJS30的抗寒性发挥调控作用。WRKY1基因在低温驯化结束时的表达量较冷处理结束时低，说明其在冷处理过程中对SJ64的抗寒性发挥调控作用。WRKY7基因在低温驯化结束时的相对表达量较冷处理结束时高，说明其在低温驯化过程中对SJ64的抗寒性构成发挥调控作用。【结论】油棕的WRKY1、WRKY7、WRKY22、WRKY40和WRKY55基因均属于低温应激反应型基因。

关键字： 油棕；WRKY转录因子；低温胁迫；实时荧光定量PCR（qPCR）；表达特性

中图分类号： S565.9 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）08-1490-08

0 引言

【研究意义】油棕（Elaeis guineensis Jacq.）属棕榈科单子叶多年生木本油料作物，是世界上产油率最高的油料植物之一（Basri et al.，2005），在我国海南、广东、广西及云南等省（区）均有种植。其喜高温，在月平均温度21 ℃以上的环境下才能正常生长，最适生长温度25～28 ℃（Verheye，2010），当气温低于18 ℃时，其生长缓慢，生殖器官发育受阻，产油量严重减少（来自于中国气候资源数据库）。可见，低温是决定油棕产油量及品质的非生物因素之一。研究发现，WRKY是植物最大的转录因子家族之一，其C端有一个锌指结构，N端有一个由约60个氨基酸残基组成的WRKYGQK结构域（谢政文等，2016），参与调控多种植物的生长发育、应激反应、生物及非生物胁迫等（余迪求等，2006；李元元等，2017；王秋颖等，2017）。因此，研究油棕WRKY基因在低温胁迫下的表达特性，对揭示其功能具有重要意义。【前人研究进展】自Ishiguro和Nakamura于1994年首次从马铃薯中克隆获得WRKY基因以来，又陆续从拟南芥（Pater et al.，1996）、油菜（Deyholos et al.，2009）、甘薯（王连军等，2013）、蒺藜苜蓿（宋辉和南志标，2014）、辣椒（刁卫平等，2015）、冬小麦（王明芳等，2015）、谷子（邢国芳等，2016）、桃（谷彦冰等，2016）、玉米（决登伟等，2017a）、桑树（刘潮等，2017）和樱桃（徐丽等，2018）等克隆获得WRKY基因。研究表明，WRKY转录因子广泛参与植物多种生理生化过程，如白梨的103个PbWRKY基因中，有44个PbWRKY在干旱胁迫下表达上调（Huang et al.，2008）；拟南芥AtWRKY25、AtWRKY26和AtWRKY33基因在低温和高盐诱导下表达明显上调（付乾堂和余迪求，2010）；陆地棉GhWRKY4基因在盐和干旱胁迫下诱导表达，GhWRKY5在干旱胁迫下诱导表达（张娜等，2012）；水稻OsWRKY基因在高盐、干旱、低温胁迫和脱落酸信号响应下具有重叠表达的特性，说明其在非生物逆境中具有功能多效性及相互间具有协同调控作用（孙利军等，2014；刘梦佳和李海峰，2016）；香蕉MaWRKY11在冷胁迫诱导下表达上调，说明其与早期应答蛋白MaERD相互作用以调控香蕉的冷胁迫抗性（徐群刚等，2015）；橡胶树HbWRKY27基因在割胶和乙烯等调控胶乳代谢中发挥重要作用，且可能与橡胶树死皮病的发生相关（闫栋等，2016）；高粱中有10个PmWRKY基因表达受干旱胁迫诱导，16个PmWRKY基因表达受低温胁迫诱导（Yue et al.，2016）；玉米中ZmWRKY22-like、ZmWRKY55-like和ZmWRKY74-like基因在果实发育过程中发挥作用，其中ZmWRKY55-like和ZmWRKY74-like基因分别参与玉米对盐和低温胁迫的响应（决登伟等，2017b，2017c）。综上，WRKY转录因子在植物生长发育和逆境胁迫响应中均发挥非常重要的作用。【本研究切入点】目前，鲜见有关油棕WRKY1、WRKY7、WRKY22、WRKY40和WRKY55基因在低温协迫下表达特性的研究报道。【拟解决的关键问题】以两个抗寒能力差异较大的油棕品种XJS30和SJ64为材料，运用生物信息学方法从其基因组中得到WRKY1、WRKY7、WRKY22、WRKY40和WRKY55基因序列，通过实时荧光定量PCR（qPCR）分析其在低温胁迫下的表达情况，为揭示油棕WRKY基因在响应逆境胁迫中的表达特性提供理论参考。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试油棕品种为XJS30和SJ64，分别采集于我国云南省保山市和海南省文昌市，其中XJS30是由中国热带农业科学院椰子研究所油棕种质资源圃经过多年的引种试种选育出抗寒性较强的油棕品种，其抗寒性较SJ64弱。主要试剂：RNA提取试剂盒购自海南海道森科技有限公司，Prime Script RT试剂盒和SYBR Green荧光定量PCR试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司，其他试剂购自海口琼山莱客（海南）科技服务中心。主要仪器设备：三色光培养箱（LED-30HL1，美国），超速冷冻离心机（Eppendorf Centrifuge 5810 R型，德國）和实时荧光定量PCR仪（安捷伦Mx 3000P，美国）等。

1. 2 样品处理及采集

选取同一时期培育，植株粗细、大小相近，无病虫害，高约75 cm，地径35～40 cm的半年生实生油棕幼苗进行盆栽，每盆栽1株，每个品种各栽3株，共6株，将其置于可控植物三色光培养箱。首先，对油棕幼苗进行低温驯化处理（昼17 ℃/夜12 ℃），分别在0 h、1 d和7 d 3个时间点进行取样，待低温驯化处理7 d后进行冷处理，并在对应的处理时间点进行取样，具体处理及取样时间见表1。

1. 3 总RNA提取及cDNA第一链合成

采用植物RNA提取试剂盒提取油棕叶片的总RNA，然后参照Prime Script RT试剂盒说明反转录合成cDNA第一链。

1. 4 引物设计及合成

从NCBI搜索获得油棕基因组序列，从Arabidopsis Information Resource（TAIR）数据库搜索获得WRKY基因，并与油棕基因组序列进行比对，找出同源基因。通过蛋白氨基酸序列比对，将存在WRKY保守结构域的蛋白编码基因判定为油棕WRKY基因。利用Primer 5.0设计油棕WRKY基因的qPCR引物，以Actin为内参基因，引物序列见表2，由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。

1. 5 WRKY基因的qPCR检测

qPCR反应体系25.0 ?L：2×SYBR Green Master Mix 12.5 ?L，10 ?mol/L的正、反向引物各1.0 ?L，40 ?mol/L cDNA模板2.0 ?L，ddH2O补足至25.0 ?L。扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 10 s，58 ℃ 25 s，72 ℃ 30 s（延伸阶段采集信号），进行30个循环后作溶解曲线（95～65 ℃，0.1 ℃/s）。每个样品重复3次，结果采用2-ΔΔCt法计算基因的相对表达量。当基因表达量上调或下调大于2倍时判定为存在表达差异。

2 结果与分析

2. 1 低温协迫下WRKY1基因的表达情况

如图1-A所示，8个处理下XJS30的WRKY1基因表达量为0.21～2.30；与处理1相比，WRKY1基因在处理3、处理4、处理5和处理6中的表达量均显著上升（P<0.05，下同），在处理2和处理8中的表达量均显著降低，在处理7中的表达量略降低，但未达显著水平（P>0.05，下同），且WRKY1基因在冷处理结束时（处理8）的表达量较低温驯化结束时（处理3）降幅较大，推测WRKY1基因在低温驯化过程中对XJS30的抗寒性构成中发挥调控作用。如图1-B所示，8个处理下SJ64的WRKY1表达量为2.61～50.30；与处理1相比，WRKY1基因在处理2、处理5、处理6、处理7和处理8中的表达量均显著上升，在处理4中的表达量略上升，但未达显著水平，在处理3中的表达量显著降低，且WRKY1基因在冷处理结束时（处理8）的表达量较低温驯化结束时（处理3）升幅较大，且在处理8中的表达量达最大值，推测WRKY1基因在冷处理过程中在SJ64的抗寒性发挥调控作用。由图1-C可知，在处理1中XJS30相对于SJ64的WRKY1基因表达量为7.50，除处理3中XJS30相对于SJ64的WRKY1基因表达量较处理1显著上升外，其他处理中的WRKY1基因表达量较处理1均显著降低，XJS30相对于SJ64的WRKY1基因表达量在低温驯化结束时（处理3）达最大值，进一步证实WRKY1基因在低温驯化过程中对XJS30的抗寒性构成发挥调控作用，在冷处理过程中对SJ64的抗寒性发挥调控作用。

2. 2 低温协迫下WRKY7基因的表达情况

如图2-A所示，8个处理下XJS30的WRKY7基因表达量为0.15～1.10；与处理1相比，WRKY7基因在处理2的表达量无显著变化，在处理3～处理8中的表达量均显著降低，尤其是处理3、处理7和处理8的降幅较大，且WRKY7基因在冷处理结束时（处理8）的表达量较低温驯化结束时（处理3）低，推测WRKY7基因在低温驯化过程中对XJS30的抗寒性构成发挥调控作用。由图2-B可知，8个处理下SJ64的WRKY7基因表达量为0.40～5.80；除WRKY7基因在处理6中的表达量较处理1显著降低外，在其他处理中的表达量均显著上升，且WRKY7基因在SJ64冷处理结束时（处理8）的相对表达量较低温驯化结束时（处理3）低，推测WRKY7基因在低温驯化过程中对SJ64的抗寒性构成发挥调控作用。由图2-C可知，在处理1中XJS30相对于SJ64的WRKY7基因表达量为3.20，除在处理6中XJS30相对于SJ64的WRKY7基因表达量较处理1显著上升至最大值外，在其他处理中的表达量均显著降低，表明WRKY7基因受低温诱导明显，对XJS30和SJ64的抗寒性均发挥调控作用。

2. 3 低温协迫下WRKY22基因的表达情况

如图3-A所示，8个处理下XJS30的WRKY22基因表达量为0.20～3.33；与处理1相比，WRKY22基因在处理2和处理4中的表达量显著上升，但在处理3、处理5、处理6和处理8中的表达量显著降低，在处理7中的表达量略降低，未达显著水平，且WRKY22基因在XJS30冷处理结束时（处理8）的相对表达量较低温驯化结束时（处理3）变幅小，推测WRKY22基因在低温驯化中对XJS30抗寒性未发挥明显的调控作用。由图3-B可知，SJ64的WRKY22基因表达量为0.23～15.30；除处理5中的WRKY22基因表达量较处理1显著降低外，其他处理中WRKY22基因表达量均显著上升，其中以处理2升幅最大；WRKY22基因在SJ64冷处理结束时（处理8）的表达量较低温驯化结束时（处理3）降幅较大，可推测WRKY22基因在低温驯化过程中对SJ64抗寒性发挥调控作用。由图3-C可知，在处理4和处理5中XJS30相对于SJ64的WRKY22基因表达量较处理1显著升高，但在其他处理的表达量显著降低；XJS30相对于SJ64的WRKY22基因表达量在处理4中达最大，且较处理1升幅较大，表明WRKY22基因受冷誘导明显，其在冷处理过程中对XJS30的抗寒性发挥调控作用。

2. 4 低温协迫下WRKY40基因的表达情况

由图4-A可知，8个处理下XJS30的WRKY40基因表达量为0.60～18.70；与处理1相比，WRKY40基因在处理3和处理7中的表达量显著下降，在处理6和处理8中的表达量略上升，但未达显著水平，WRKY40基因在处理2、处理4和处理5中的表达量显著上升，其中以处理4的表达量升幅最大，推测WRKY40基因在冷处理中对XJS30的抗寒性发挥调控作用。由图4-B可知，SJ64的WRKY40基因表达量为0.78～3.81；与处理1相比，在处理2、处理3、处理6和处理7中的表达量显著上升，其中以处理2的表达量升幅最大，在处理4中的表达量显著降低，且WRKY40基因在SJ64冷处理结束时（处理8）的表达量较低温驯化结束时（处理3）变幅较小，推测WRKY40基因在低温驯化和冷处理中对SJ64的抗寒性无明显调控作用。由图4-C可知，在处理1中XJS30相对于SJ64的WRKY40基因表达量为0.31，除处理4中XJS30相对于SJ64的表达量较处理1显著上升外，其他处理的表达量降低或无显著上升，表明WRKY40基因受低温诱导明显，其在低温冷处理过程中对XJS30的抗寒性发挥调控作用。

2. 5 低温协迫下WRKY55基因的表达情况

由图5-A所示，8个处理下XJS30的WRKY55基因表达量为0.13～13.40；WRKY55基因在低温驯化中（处理1～处理3）的表达量呈显著降低趋势，在处理4中的表达量显著上升至最大值，随后，在处理5、处理7和处理8中的表达量较处理1显著上升，仅在处理6中的表达量为显著降低，推测WRKY55基因在冷处理过程中对XJS30的抗寒性发挥调控作用。由图5-B可知，SJ64的WRKY55基因表达量为0.32～1.58；WRKY55基因在低温驯化中（处理1～处理3）的表达量呈显著降低趋势，在处理4中的表达量显著上升至最大值，随后，处理5和处理8中的表达量较处理1显著降低，其他处理中的表达量与处理1无显著差异；WRKY55基因在SJ64冷处理结束时（处理8）的表达量较低温驯化结束时（处理3）变幅小，且冷处理过程中的表达量总体上较处理1变幅小，推测WRKY55基因对SJ64的抗寒性无明显的调控作用。由图5-C可知，处理1中XJS30相对于SJ64的WRKY55基因表达量为0.03；与处理1相比，XJS30相对于SJ64的WRKY55表达量在处理4、处理5和处理8中均显著上升，以处理5中的表达量最大，在处理2、处理3、处理6和处理7中均下降，但除处理6外均未达显著水平，表明WRKY55基因受低温诱导明显，其在低温冷处理过程中对XJS30的抗寒性发挥调控作用。

3 讨论

近年来，WRKY转录因子基因家族已成为研究热点，在植物的生长发育及生物和非生物胁迫抗性中均发挥重要的调控作用（颜君等，2015）。谷彦冰等（2015）通过对苹果的42个WRKY基因进行表达分析，发现不同基因在各组织中的表达量存在差异，其中有7个WRKY基因在各组织中均不表达，有2个基因（MdWRKY1和MdWRKY110）仅在根中表达，有1个基因（MdWRKY16）仅在花中表达。向小华等（2016）研究发现，普通烟草的164个WRKY基因中，大部分可在根、茎和叶中表达，但不同基因的表达模式不同，其中NtWRKY26、NtWRKY30和NtWRKY32基因的表达模式受黑胫病病原菌诱导。孔维龙等（2017）研究表明，甜菜在热胁迫条件下其BvWRKY16、BvWRKY21、BvWRKY20、BvWRKY22、BvWRKY32、BvWRKY33和BvWRKY34均上调表达；盐胁迫条件下其BvWRKY1、BvWRKY6、BvWRKY19、BvWRKY31和BvWRKY33均上调表达，表明BvWRKY33对热胁迫和盐胁迫均有明显响应。本研究结果表明，冷处理下两个油棕品种XJS30和SJ64的WRKY1、WRKY7、WRKY22、WRKY40和WRKY55的表达量存在明显差异，WRKY1基因在XJS30低温驯化结束时的表达量比冷处理结束时的表达量高，推测WRKY1基因在低温驯化中对XJS30的抗寒性构成发挥调控作用；WRKY1基因在SJ64低温驯化结束时的表达量比冷处理结束的表达量低，且在冷处理结束时的表达量达最大值，推测WRKY1基因在冷处理过程中对SJ64的抗寒性发挥调控作用；WRKY7基因的表达量分别在XJS30冷处理和SJ64低温训化中达最大值，推测WRKY7对两个油棕品种的抗寒性均发挥调控作用，进一步证实Xu等（2014）的研究结果即WRKY7基因受低温诱导表达，并参与信号转导途径中的早期基因调控；WRKY22、WRKY40和WRKY55基因均在XJS30冷处理中表达量最高，其中WRKY22基因及WRKY40基因在XJS30相对于SJ64中的表达量达最大（处理4），WRKY55基因在XJS30相对于SJ64中的表达量达最高（处理5），且与处理1相比升幅较大，与王明芳等（2015）研究報道的冬小麦WRKY40和WRKY55基因的表达模式相似，即在低温胁迫下表达显著上调，推测WRKY22、WRKY40和WRKY55在XJS30的抗寒性发挥调控作用。

4 结论

油棕的WRKY1、WRKY7、WRKY22、WRKY40及WRKY55基因均属于低温应激反应型基因，其中WRKY22、WRKY40和WRKY55在不同冷处理下表达差异显著，对XJS30的抗寒性发挥重要的调控作用。

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（責任编辑 陈 燕）