低氧对斑马鱼细胞存活能力的影响

武晓会 刘洋 狄治朝 赵文静 王丛丛 许强华

摘要：【目的】明确低氧对斑马鱼细胞存活和抗氧化酶系统的影响，为揭示鱼类细胞低氧适应机理打下基础。【方法】采用不同浓度低氧处理斑马鱼胚胎上皮细胞（ZF-4细胞），检测低氧对其存活率的影响，并分析低氧应激下ZF-4细胞中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽（GSH）、一氧化氮合酶（NOS）活性及丙二醛（MDA）和一氧化氮（NO）含量的变化。【结果】1.0% O2处理可促进ZF-4细胞存活；SOD活性呈先降低后升高的变化趋势，在处理24 h时达最高值；CAT活性呈先降低后升高再降低的波动变化趋势，于处理8 h时达最低值；GSH活性在处理16 h时达最高值，随后开始下降；MDA含量与对照组无显著差异（P>0.05）；NO含量和NOS活性在处理16 h时达最高值。经0.1% O2处理8 h后ZF-4细胞的存活率达最高值；SOD活性在处理24 h时显著高于对照组（P<0.05，下同）；经0.1% O2处理后CAT活性极显著降低（P<0.01，下同），GSH活性则从处理8 h后极显著高于对照组；MDA含量显著或极显著降低；NO含量和NOS活性极显著降低。【结论】在极端缺氧环境下，斑马鱼细胞主要通过提高SOD和GSH等抗氧化酶活性以提高细胞的低氧适应能力，从而促进细胞存活。

关键词： 斑马鱼；ZF-4细胞；低氧；氧化应激；抗氧化酶；存活能力

中图分类号： S965.816 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）08-1641-07

0 引言

【研究意义】在动物的生存过程中氧气（O2）是限制性因子，对机体的生长发育及各项生理活动均有重要影响。低氧作为一种应激源，可引起生物体组织损伤、代谢紊乱、氧自由基含量增加、细胞膜受损、核酸结构破坏等一系列应激反应，甚至死亡（王剑，2010）。为了适应低氧环境，生物体在长期进化过程中已形成一套完整的内源性抗氧化酶防御体系，主要由小分子抗氧化剂和抗氧化酶组成。抗氧化酶主要有超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px），小分子抗氧化剂包括类胡萝卜素、维他命、硫氧还原蛋白和谷胱甘肽（GSH）等（赵燕静等，2016）。丙二醛（MDA）是内源性防御系统中自由基攻击膜不饱和脂肪酸的产物，其含量可反映细胞遭受的過氧化损伤程度。一氧化氮（NO）是一种内源性血管舒张因子，也是一类结构简单的信使分子，在生理状态下能够传递信息，在病理状态下则对细胞产生毒性作用（谢印芝等，2000）。因此，探讨不同低氧对斑马鱼细胞存活、抗氧化酶系和生理代谢相关指标的变化，可为鱼类细胞低氧适应性研究提供理论依据。【前人研究进展】至今，有关低氧对细胞存活及抗氧化酶系的影响已有较多研究报道。Tzeng等（2010）研究发现，以0.1% O2处理SH-SY5Y细胞，其存活能力降低。郭会彩等（2012）研究证实，间歇性低氧可提高机体的抗氧化活性，从而发挥抗氧化作用。何云凌等（2013）研究发现，PC12细胞经10.0% O2处理后存活能力增强，但经0.3% O2处理后存活能力下降。唐燕红等（2013）研究表明，随低氧时程的延长甘肃鼢鼠细胞SOD活性先增加后恢复至正常水平，CAT活性变化不明显，MDA也无显著变化。杜莉莉等（2016）研究证实，缺氧能促进胎盘间充质干细胞（pMSCs）分泌胰岛素样生长因子1（IGF-1），而IGF-1可促进H2O2处理的人结肠腺癌细胞（Caco2）增殖，抑制其凋亡。赵燕静等（2016）研究发现，淇河鲫肝胰脏SOD、CAT和GSH-Px活性随溶解氧含量降低呈先升高后降低的变化趋势，MDA含量则随溶解氧含量降低而持续升高。李艳丽等（2017）研究了低氧条件下血红素加氧酶1（Ho1）对斑马鱼的保护作用，结果显示抑制Ho1表达可导致低氧条件下斑马鱼胚胎上皮细胞（ZF-4细胞）存活率明显降低。杨明阳（2017）分别以低氧和高氧处理斑马鱼胚胎，结果发现常氧和高氧条件下斑马鱼胚胎的存活率无显著差异（74.00%～76.00%），但低氧条件下胚胎的存活率仅为43.98%。近年来，NO与低氧的关系已成为研究热点，但结论并不完全一致，多数学者认为低氧通过抑制一氧化氮合酶（NOS）活力而抑制NO的产生和释放，也有学者认为低氧提高了NOS活力（谢印芝等，2000）。刘梅等（2012）研究表明，大鼠脑缺血6～24 h其NO含量逐渐增加；毋亚男等（2017）研究表明，白藜芦醇可明显增加NO含量及NOS活性。综上所述，低氧条件下细胞存活率升高或降低均与抗氧化酶活性有关。【本研究切入点】目前，有关氧化应激研究集中在由药物或间歇性低氧引起的应激反应，且主要针对哺乳动物细胞，而由急性低氧引起的水生动物细胞氧化应激鲜有报道。【拟解决的关键问题】以斑马鱼细胞为模型，经不同浓度低氧处理后检测低氧对其存活率的影响，并分析低氧应激下斑马鱼细胞中相关酶SOD、CAT、GSH、NOS活性及MDA和NO含量的变化，明确低氧对斑马鱼细胞抗氧化水平的影响，为揭示鱼类细胞低氧适应机理打下基础。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

ZF-4细胞购自中国科学院ATCC细胞库，由大洋渔业资源可持续开发省部共建教育部重点实验室保存传代。DMEM高糖培养基、青霉素和链霉素购自HyClone公司，胎牛血清购自Gibco公司，阿尔玛蓝（Alamar Blue）购自Invitrogen公司，SOD、GSH、MDA、CAT、NO和NOS测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。主要仪器设备有CO2恒温培养箱（Thermo）、低氧培养箱（Thermo）和酶标仪（Flex Station）等。

1. 2 细胞培养

ZF-4细胞复苏后用含10%胎牛血清的DMEM培养基（添加100×103 U/L青霉素和100×103 g/L链霉素）进行培养，在细胞培养箱中孵育3 d，待细胞汇合度达90%时用胰酶消化并传代。对照组：常氧培养（28 ℃、21.0% O2、5.0% CO2）获得的ZF-4细胞；试验组I：常氧培养24 h后，分别在28 ℃、1.0% O2、5% CO2条件下培养4、8、16和24 h的ZF-4细胞；试验组II：常氧培养24 h后，分别在28 ℃、0.1% O2、5% CO2条件下培养4、8、16和24 h的ZF-4细胞。每个时间点设3个平行样本。

1. 3 细胞存活率测定

待细胞汇合度达85%～95%后，将ZF-4细胞转移至96孔板中，分别将试验组和对照组每孔更换100 μL新鲜的培养基混合物（90 μL培养基+10 μL Alamar Blue），继续避光低氧培养2 h，待培养基颜色由靛蓝开始变成粉红色时，用酶标仪测570和600 nm处的吸光值（A），并计算细胞存活率（何云凌等，2012）。

1. 4 细胞氧化损伤相关指标检测

细胞样本经胰酶消化后，加入适量PBS，采用手持匀浆器在冰上制备匀浆，1000 r/min离心15 min，取上清液，按相关试剂盒说明书分别检测SOD、CAT、GSH、NOS活性及MDA和NO含量。

1. 5 统计分析

采用SPSS 17.0进行试验数据统计处理，并以One-way ANOVA进行差异显著性分析（韦日明等，2016）。

2 结果与分析

2. 1 低氧胁迫下ZF-4细胞的存活率

由图1可看出，ZF-4细胞经1.0% O2处理后，其存活能力明显高于对照组，尤其是处理8～24 h的存活率极显著升高（P<0.01，下同）。经0.1% O2处理4 h的ZF-4细胞存活能力显著升高（P<0.05，下同），处理8 h的存活率达最高值，此后随低氧胁迫时间的延长，细胞存活率开始下降直到趋于对照组水平。

2. 2 低氧胁迫下ZF-4细胞氧化应激酶活性的变化

2. 2. 1 SOD活性 经1.0% O2处理后，ZF-4细胞SOD活性呈先降低后升高的变化趋势，于处理8 h时达最低值，随后逐步升高，至24 h时极显著高于对照组（图2-A）；经0.1% O2处理后0～16 h，ZF-4细胞SOD活性无显著变化（P>0.05，下同），但至24 h时，SOD活性较对照组显著升高（图2-B）。

2. 2. 2 CAT活性 ZF-4细胞经1.0% O2处理后，其CAT活性呈先降低后升高再降低的波动变化趋势，于处理8 h时达最低值，至16 h时恢复到对照组水平，但到24 h时又极显著降低（图3-A）；经0.1% O2处理后，ZF-4细胞CAT活性极显著降低，虽然至24 h时有所回升，但仍极显著低于对照组（图3-B）。

2. 2. 3 GSH活性 经1.0% O2处理4～16 h的ZF-4细胞GSH活性逐渐升高，至16 h时达最高值，随后GSH活性开始下降（图4-A）；经0.1% O2处理8～24 h后，ZF-4细胞GSH活性极显著高于对照组（图4-B）。

2. 2. 4 MDA含量 经1.0% O2处理后，ZF-4细胞MDA含量除在处理16 h时略低于对照组外，其他时间点与对照组基本一致（图5-A）；经0.1% O2处理4～8 h，ZF-4细胞MDA含量呈极显著下降趋势，于处理8 h时达最低值，随后MDA含量有所回升，但仍显著低于对照组（图5-B）。

2. 3 低氧胁迫下ZF-4细胞NO含量及NOS活性的变化

2. 3. 1 NO含量 从图6可看出，ZF-4细胞经1.0 % O2处理4～16 h，其NO含量逐渐升高，于处理16 h时达最高值，但处理24 h后ZF-4细胞NO含量急剧下降；经0.1% O2处理后，ZF-4细胞NO含量均极显著低于对照组。

2. 3. 2 NOS活性 经1.0% O2处理后，ZF-4细胞NOS活性呈先降低后升高再降低的变化趋势（图7-A），于处理16 h时达最高值，极显著高于对照组；经0.1% O2处理后，ZF-4细胞NOS活性较对照组极显著降低（图7-B）。NOS是NO生成的关键酶，因此ZF-4细胞NOS活性变化与其NO含量变化基本吻合。

3 讨论

O2是生物生存的必要条件，通常把低于空气中20.0% O2的浓度称为低氧。在生理条件下，机体脑组织中的O2浓度为0.5%～7.0%（Ivanovic，2009），胚胎中的O2浓度在3.0%左右（Genbacev et al.，2001）。在病理条件下，低氧可引起肺组织病变或心肌梗死等。可见，低氧程度决定生物体处于生理状态还是病理状态。在体外培养中，低氧对细胞存活能力的影响是判断低氧程度的一项重要指标。Morrison（2001）研究表明3.0% O2可促进神经干细胞增殖，Galvin等（2005）研究发现1.0% O2能抑制膀胱滑肌细胞增殖。说明不同浓度低氧对细胞的影响不同，轻度低氧能促进细胞存活，而重度低氧不利于细胞存活。本研究结果表明，1.0% O2处理可提高ZF-4细胞的存活率，而0.1% O2处理虽然在前8 h內促进了细胞存活，但处理16～24 h后对细胞的存活率影响不明显。即适度低氧胁迫可促进ZF-4细胞存活。

在正常生理状况下，细胞中存在的抗氧化酶和抗氧化物质可有效清除氧化产生的自由基。SOD能清除机体内过多的氧自由基，促使 生成H2O2和O2，是机体的第一道防线，随后由CAT和GSH将H2O2催化生成H2O和O2，即第二道防线（杨文君等，2010）。GSH水平变化可反映氧化应激的程度（区又君等，2017）。谢惠春（2016）研究表明，甘肃鼢鼠以SOD作为第一道防线清除低氧产生的自由基，GSH作为第二道防线清除低氧产生的多余H2O2，同时将CAT作为次要手段以清除体内的H2O2；区又君等（2017）研究发现，急性低氧胁迫下卵形鲳鲹SOD和GSH的活性先升高后下降，CAT活性则先下降后缓慢升高。本研究结果表明，ZF-4细胞经不同浓度低氧处理后，其SOD、GSH和CAT活性变化趋势并不一致，可能与ZF-4细胞的氧自由基代谢途径有关。经低氧胁迫后，SOD和GSH活性整体上呈上升趋势，CAT活性呈下降趋势，推测ZF-4细胞主要是通过SOD和GSH清除氧自由基。MDA是自由基攻击膜不饱和脂肪酸的产物，其含量能反映细胞遭受过氧化损伤的程度。吴志昊等（2011）研究表明，在极低氧条件下大菱鲆肝脏中MDA含量下降，受到的过氧化损伤程度减轻；李根瑞等（2016）研究表明，低氧胁迫可使刺参肌肉中的MDA含量降低。本研究结果显示，经1.0% O2处理后ZF-4细胞MDA含量无显著变化，而经0.1% O2处理后MDA含量显著或极显著降低。因此推测，在极低氧条件下SOD和GSH活性处于较高水平，细胞中的部分氧自由基被清除，确保细胞中的氧自由基没有集聚，而导致细胞产生的脂质过氧化物较少。

在生物体内，NO具有双重作用，既是一种活性很强的气体分子，又是细胞内和细胞间的信使，在生理状态下能传递信息，维持正常的生理作用，但在病理状态下NO对细胞产生毒性作用（刘祥梅等，2008）。NOS作为NO合成的关键酶，其含量及活性的变化是引起NO含量升高或降低的重要因素。谢印芝等（2000）研究表明，经急性低氧胁迫后大鼠的脑和肺组织中NO水平和NOS活力明显下降；Min等（2006）研究发现，急性低氧可增加离体的牛动脉内皮细胞NO生成或先抑制NOS活性，但经过一定适应期后，可增强NOS活性，进而增加NO生成。本研究发现，经1.0% O2处理16 h后，ZF-4细胞NO含量和NOS活性均达最大值；而经0.1% O2处理后，ZF-4细胞NO含量和NOS活性极显著降低。即适度低氧在一定时间内能增加NOS活性及NO含量，但重度低氧易抑制NOS活性和降低NO含量，其原因可能是NO的生成除了与NOS活性降低有关外，还与NO的重要底物（O2）有关，但具体原理有待进一步探究。

4 结论

在极端缺氧环境下，斑马鱼细胞主要通过提高SOD和GSH等抗氧化酶活性以提高细胞的低氧适应能力，从而促进细胞存活。

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（責任编辑 兰宗宝）