考马斯亮蓝法测定蛋白质含量中的细节问题

蒋大程，高 珊，高海伦，邱念伟

(曲阜师范大学 生命科学学院，山东 曲阜 273165)

1921年，Folin首创了测定可溶性蛋白质含量的方法，此法的原理是蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基(酚基)与酚试剂(磷钨酸-磷钼酸)可发生蓝色反应，蓝色化合物的颜色深浅与蛋白质浓度呈正比。这一方法被命名为Folin-酚试剂法，该法的缺点是灵敏度较低[1]。1951年，Lowry对Folin法进行了改进，他发现在碱性溶液中，蛋白质分子中的肽键可与碱性铜试剂中的Cu2+螯合，形成蛋白质-铜复合物，该复合物能够与Folin酚试剂反应产生蓝色化合物[1-2]，这一改进大大提高了测定的灵敏度，改进后的方法被称为“Lowry法”。不过Lowry法仍存在测定范围窄、使用试剂多、干扰物质多、耗费时间长、反应时间难以控制等缺点[3-4]。1976年美国科学家Bradford用考马斯亮蓝G250与蛋白质结合的方法来定量测定蛋白质含量。考马斯亮蓝法是目前实验室中最常见、灵敏度最高的一种测定蛋白质含量的方法[5-6]。它将比色法和染料结合法相结合，与其他传统方法相比具有许多突出的优点，被广泛应用于各类生物材料的可溶性蛋白含量测定，是生物化学、植物生理学、分子生物学、食品科学等实验课程中的经典实验项目之一。首先，考马斯亮蓝法所需的样品量少，蛋白质与染料结合后产生的复合物颜色稳定，消光系数高，光吸收值随蛋白质含量的变化比Lowry法灵敏得多，可检测的蛋白质数量低达1 μg[7]。其次，该方法测定速度快，完成一个样品的测定，只需要5 min左右。第三，不像Lowry法那样试剂较多，费时费力，需要严格控制反应时间[8]，考马斯亮蓝法操作简便，只需加一种考马斯亮蓝试剂，适合于大批量样品蛋白质含量的测定。此外，该方法还具有干扰物质少的优点。

考马斯亮蓝法虽然操作简单，但在操作过程中，仍有许多细节问题容易被忽视，从而导致实验结果出现偏差甚至错误。相关教材和文献中只介绍了3～4项重要的注意事项[9-11]，还有很多操作细节并未提及。曲阜师范大学生物学实验中心在长期的教学和科研中，积累了测定蛋白质含量的丰富经验，总结了30余条实验注意事项，分为仪器设备的操作、试剂的配制与保存、标准曲线的绘制、样品蛋白质的提取、样品吸光度的测定5个方面，旨在培养精益求精、一丝不苟的科学态度。生物科学实验中细节决定成败，掌握这些细节有助于提高实验准确性和成功率，也有助于提高学生的实验技能。

1 实验原理

在酸性溶液中，考马斯亮蓝G250(Coomassie brilliant blue G250)染料主要与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸和赖氨酸)[12]和芳香族氨基酸的残基通过疏水力相结合，从而使染料的最大吸收峰(lmax)由波长465 nm变为波长595 nm，溶液的颜色由棕红色变为蓝色[13]。在一定蛋白质浓度范围内(1～1 000 μg/mL)，溶液在波长595 nm处的吸光度与蛋白质浓度呈线性关系。根据标准蛋白溶液绘制标准曲线，就可通过测定样品在波长595 nm的吸光度计算样品的蛋白质浓度；然后根据公式计算生物样品的可溶性蛋白质含量。

2 实验试剂与仪器

2.1 试剂

1)考马斯亮蓝试剂。

取考马斯亮蓝G250 100 mg溶于50 mL 95%乙醇中，加入100 mL 85%W/V磷酸，用蒸馏水稀释至1 000 mL，过滤后备用。

2)标准蛋白质溶液。

用0.2 mol/L pH 7.0磷酸缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)将结晶牛血清蛋白配制成1 mg/mL标准蛋白质溶液。

3)磷酸缓冲液。

用蒸馏水将KH2PO42.12 g和K2HPO45.56 g分别溶解，混合后定容至200 mL，配成0.2 mol/L pH 7.0的磷酸缓冲液。

2.2 仪器

紫外可见光分光光度计、比色皿、移液枪、冷冻离心机、离心管、分析天平、药匙、研钵、研杵、烧杯、量筒、试管、试管架、玻璃棒和剪刀。

3 实验步骤

3.1 制作标准曲线

1)取7支试管，按表1平行操作，每个浓度做3个重复。加入标准蛋白溶液和考马斯亮蓝后，立即摇匀，5～20 min内以1号管为空白对照，在波长595 nm处测定吸光值，填入表1。

表1 标准曲线的绘制

2)绘制标准曲线。以标准蛋白质浓度为横坐标，以A595为纵坐标，参照文献[14]的方法，用Excel办公软件绘制蛋白质标准曲线。

3.2 未知样品蛋白质含量测定

取待测植物材料1.0 g，用少量石英砂和10 mLPBS研磨提取，研磨后经两步离心(12 000 g 6 min和26 900 g 16 min)，取其上清液即为蛋白提取液。将0.1 mL蛋白提取液和5 mL考马斯亮蓝试剂混合，2 min后即可测定其吸光度。每个样品做5个重复，取其吸光度的平均值代入标准曲线方程，求出样品蛋白质浓度。然后代入式(1)计算植物材料蛋白质含量。

(1)

4 注意事项

4.1 实验仪器设备

1)用到的所有玻璃器皿必须用蒸馏水清洗干净，晾干备用。因为在实验过程中，仍有一些物质干扰蛋白质含量的测定，主要的干扰物质有强碱性缓冲液、去污剂、Triton X-100、十二烷基硫酸钠等[15]。所以在清洗玻璃器皿过程中使用去污剂、强碱性物质时，一定要冲洗干净。

2)比色皿内外壁都需清洗，保证比色皿干净透明，晾干或冷风吹干后待用(湿润的比色皿壁接触考马斯亮蓝溶剂后会发蓝)。为减小实验误差，测定前可先用少量待测液润洗比色皿，然后再进行测定。

3)待测液体积大约为比色皿容积的2/3即可，溶液过满容易外溢。流到比色皿外壁的待测液要及时用沾有酒精的吸水纸擦拭干净，以免影响比色皿的透光率。

4)比色皿使用后，会残留蓝色染料，干燥后很难清洗，须用酒精及时洗涤干净。一定不能将比色皿长期浸泡在酒精中，否则比色皿会因粘胶被溶解而散架(比色皿上的两块透明玻璃是用胶黏上的)。

5)拿取比色皿时，只能接触两侧的毛玻璃面，严禁用手指触摸透光面[16]，以免留下指纹，影响测定准确性。

6)严禁用硬物擦拭比色皿的透光面，以免产生划痕；应使用镜头纸或丝绸顺着同一方向擦拭干净。

7)考马斯亮蓝可以与石英比色皿产生强烈的结合，因此本实验建议使用玻璃或塑料比色皿[17]。

8)测试的同一批样品必须使用同一套比色皿[18]，不同厂家、不同批次的比色皿透光率不同，会影响测定结果。

9)分光光度计使用前应预热20 min[19]，使光源达到稳态，此时测量的数值会比较稳定。

10)使用移液管或移液枪移取液体体积要精确，为减小人为误差，最好由同一个人操作。

4.2 试剂的配制与保存

1)在配制考马斯亮蓝试剂时，应先加入考马斯亮蓝G250粉末和乙醇，溶解后再加入磷酸，最后用蒸馏水定容。考马斯亮蓝试剂必须要经过过滤后才能使用，滤液应为浅棕红色，与蛋白质结合后呈蓝色，配制好的试剂可在4℃下棕色瓶中保存1个月。

2)考马斯亮蓝有G-250和R-250两种类型。测定蛋白质含量必须使用考马斯亮蓝G-250；考马斯亮蓝R-250与蛋白质反应缓慢，可以被洗脱，只能用于蛋白质电泳条带的染色[20]。

3)应预先通过微量凯氏定氮法测定结晶牛血清蛋白的氮含量，根据其纯度，再用磷酸缓冲液配制标准蛋白质溶液[13]。配置好的标准蛋白质溶液分装后可冷冻保存6个月。

4)标准蛋白溶液母液(1 mg/mL)可以先分别稀释成不同浓度梯度的标准溶液，然后分别吸取0.1 mL绘制标准曲线，以减少取样误差，稀释方法如表2所示。

表2 标准蛋白溶液的稀释

5)标准蛋白质溶液、考马斯亮蓝试剂、磷酸缓冲液恢复至室温后再使用，因为低温会影响染色效果，并使比色皿壁产生水雾。

4.3 标准曲线的绘制

1)各种蛋白质中碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸含量不同，因此考马斯亮蓝法用于测定不同蛋白质含量时有较大偏差，为减少这方面的偏差，在制作标准曲线时，一般以牛血清蛋白作为标准蛋白质。

2)由于试剂保存时间以及贮藏条件等因素的影响，各试剂成分会有变化，影响测量结果。因此，每次实验均需要重新绘制标准曲线。

3)实验过程中，若考马斯亮蓝试剂不足，重新配置后，应重新绘制标准曲线。

4)标准曲线上的每个浓度点应做3个重复，若无异常值，则取3个重复的平均值；若有异常数据，则去掉异常数据后取平均值。若某个浓度点的3个数据全部异常，则应重做该浓度点或者删除该浓度点，标准曲线上浓度点应不少于5个(含零浓度点)。

5)一般要求标准曲线的相关系数达到0.99，才能保证实验结果的精确性[14]。

6)标准蛋白浓度过高时，该浓度点会偏离标准曲线，应将该点删除。

7)徒手绘制标准曲线误差较大，标准曲线应采用Excel等办公软件绘制[14]。

4.4 样品蛋白质的提取

1)每种样品建议做5个重复以上，取材要均一，以增加实验结果的可靠性和稳定性。

2)蛋白质提取过程中用到的研钵、研杵等仪器以及磷酸缓冲液需提前预冷，提取过程(包括离心)应在低温(0～4℃)下进行，以防止植物组织中的蛋白酶降解蛋白质。

3)研磨要充分，研磨时应先加2 mL磷酸缓冲液，研磨成匀浆后(提取液加入过多，叶片漂浮在液面上，难以研磨充分)，再用2～3 mL磷酸缓冲液继续研磨提取。最后用剩余的磷酸缓冲液冲洗研钵和研杵，合并蛋白质提取液，混匀后离心。

4.5 样品吸光度的测定

1)测定样品在波长595 nm处的吸光度时，以5 mL考马斯亮蓝试剂和0.1 mL磷酸缓冲液混匀后调零。

2)在加入考马斯亮蓝溶液和蛋白样品混匀后，染料与蛋白质的结合需约2 min达到平衡。在5～20 min内，结合最为稳定，此时测定吸光度最为可靠[21]。超过1 h，蛋白质就会明显沉淀。

3)为避免反复清洗比色皿，测定标准样品吸光度时，可从低浓度到高浓度测定，这样干扰和误差较小。

4)做标准曲线及测定样品时，吸光度应在0.1～0.6之间(常见实验中吸光度一般要求在0.1～0.8)，因为考马斯亮蓝溶液在波长595 nm处的本底吸光度较高，约为0.2～0.3。所以样品吸光度高于0.6时，吸光度与蛋白质浓度已不成正比，此时应将蛋白质提取液用磷酸缓冲液稀释至合适浓度后再进行测定。

5)不必每测定一个样品就清洗一次比色皿，同一处理的多个重复样品可用同一个比色皿连续测定。不同处理的样品应清洗比色皿，并晾干或吹干后再进行测定。

6)测定结束后可用乙醇将比色皿中的蓝色染料溶解洗涤下来，然后用蒸馏水冲洗干净，晾干备用。

7)考马斯亮蓝试剂不与单体氨基酸以及相对分子量小于3 kDa的多肽结合，多肽类激素和很多重要的活性肽分子量都低于3 kDa，考马斯亮蓝法不能用于这些蛋白质和氨基酸的浓度测定[22]。

5 结束语

蛋白质含量测定是生物学中的经典实验，该实验涉及很多技术细节和专业知识，忽视任何一个细节都会导致实验结果出现偏差，没有经验的初学者测定的结果往往是错误的，他们既不知道实验结果的可靠性，也不知道实验失败的原因。本文从5个方面系统总结了本实验项目的操作细节，不仅有助于学生熟练掌握该项实验技术，而且对其他类似实验项目也具有很好的参考价值。本文已经将上述实验技术细节应用到科研和教学中，使得蛋白质含量测定结果的准确性和稳定性大大提高，也拓展了学生的专业知识，提高了学生的实验技能，培养了学生严格、认真、细致的科研素质。