自噬相关蛋白Bec lin1、LC3-Ⅱ、Atg5在前列腺腺癌组织中的表达及意义

王钱虎

310006 杭州市第一人民医院中心实验室

前列腺腺癌（prostatic adenocarcinoma，PCa）是常见的男性泌尿生殖系恶性肿瘤之一，在全世界范围内其发病率居第2位，死亡率居第5位[1]。在我国PCa是男性泌尿生殖系发病率最高的肿瘤，其年发病率高达12.07%。PCa早期临床症状不典型，确诊时大多已为进展期，24%～35%的患者在初诊时已发生转移[2]。PCa分为腺癌、腺鳞癌、导管腺癌、鳞状细胞癌、尿道上皮癌等五大类，其中腺癌占90%以上[3]。自噬又称Ⅱ型程序性细胞死亡，在机体生理病理过程发挥广泛而重要的作用；而且，自噬与肿瘤的发生、发展之间有密切关系[4]。有研究发现，自噬在PCa的发生、发展及转归中发挥重要作用[5]。本研究应用免疫组化法检测PCa中自噬相关蛋白Beclin1、微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ（LC3-Ⅱ）、自噬相关基因5（autophagyrelated gene 5，Atg5）的表达情况，并分析其与Gleason分级、前列腺特异性抗原（prostate specific antigen，PSA）和临床各参数的相关性，以探讨自噬活动在PCa发病中的作用。

1 对象和方法

1.1 对象 收集2014年3月至2016年3月在我院病理科保存的经直肠前列腺穿刺活检PCa标本60例（观察组），患者年龄 55～72（69.4±10.2）岁；按照 Gleason评分[6]：高分化（2～4分）16例，中分化（5～7分）18例，低分化（8～10分）26例。同时选择良性前列腺增生（benign prostatic hyperplasia，BPH）标本15例作为对照组，患者年龄 53～70（67.3±10.4）岁。两组患者术前均未行放化疗或内分泌治疗。两组患者年龄比较无统计学差异（P＞0.05）。

1.2 主要试剂 PSA检测试剂盒（美国雅培公司）；Beclin1、LC3－Ⅱ、Atg5兔抗人单克隆抗体（美国 EPITMICS公司）；链霉素抗生物素蛋白－过氧化物连接法(SP)试剂盒及二氨基联苯胺（DAB）显色液（武汉博士德生物技术公司）。

1.3 血清PSA的检测 在清晨安静情况下抽取患者静脉血4ml，采用化学免疫发光法检测PSA，操作步骤严格按照说明书执行。

1.4 免疫组化染色 石蜡标本连续切片，常规脱蜡及水化，高压热修复抗原，封闭内源性过氧化物酶，依次加入 Beclin1、LC3－Ⅱ、Atg5一抗（均为 1∶1 000稀释），洗涤后加入辣根过氧化酶标记二抗，DAB显色，苏木素复染，常规脱水、透明及封片。

1.5 阳性结果判断 由2位高年资病理医师采用盲法独立阅片，每张切片至少观察5个高倍镜视野。参照文献[7]，按照染色强度评分：无色计0分，淡黄色计1分，棕黄色计2分，褐黄色计3分。按照阳性细胞所占百分比评分：阴性计0分；阳性细胞＜10%计1分，＞10%计2分，＞50%计3分，＞75%计4分。总积分（即上述2项评分的乘积）：0分为阴性，1～3分为弱阳性，4～6分为中强阳性，＞6分为强阳性。

1.6 统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件。正态分布的计量资料以表示，组间比较采用t检验。计数资料用百分比表示，组间及不同临床病理特征间自噬相关蛋白阳性率比较采用χ2检验，相关性分析采用Spearman等级相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者Beclin1、LC3－Ⅱ、Atg5阳性表达率的比较 Beclin1、LC3－Ⅱ、Atg5阳性表达均主要位于细胞质。观察组中Beclin1、LC3－Ⅱ阳性表达率明显低于对照组，但Atg5阳性表达率显著高于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。见表1。

表1 两组患者B ec l in1、LC3-Ⅱ、A t g5阳性表达率的比较[例（%）]

2.2 PCa组织中 Beclin1、LC3－Ⅱ、Atg5 表达与临床参数的关系 Beclin1、LC3－Ⅱ的表达与Gleason评分、血清PSA水平、淋巴结转移、骨转移均有关（均P＜0.05）；而与年龄无关（P＞0.05）。Atg5的表达与年龄、Gleason评分、血清PSA水平、淋巴结转移、骨转移均无关（均P＞0.05）。见表 2。

表2 P C a组织中B ec l in1、LC3-Ⅱ、A t g5蛋白表达与临床参数的关系[例（%）]

2.3 相关性分析 Beclin1与LC3－Ⅱ呈正相关（r=0.574，P＜0.05），而 Beclin1和 LC3－Ⅱ与 Atg5呈负相关（r=－0.513、－0.525，均 P＜0.05）。Beclin1 和 LC3－Ⅱ与 Gleason评分呈正相关（r=0.542、0.547，均 P＜0.05），而Atg5与Gleason评分无明显相关（r=0.035，P＞0.05）。

3 讨论

自噬是真核生物特有的进化上高度保守的代谢方式，它能通过清除氧自由基和受损细胞器，维持内环境稳态和基因组稳定，抑制肿瘤发生、发展；如自噬活性受损时，也可促进细胞恶变及肿瘤的发展[8]。自噬体的形成是一个涉及两种泛素样系统和多个自噬相关蛋白的多步骤过程，自噬体形成后与溶酶体融合，进而形成自噬溶酶体，将其吞噬的内容物降解掉。自噬体形成主要包括三个阶段：起始阶段：自噬小泡膜开始形成；延长阶段：自噬小泡膜不断弯曲、延长，进而包裹被吞噬的成分；融合阶段：自噬小泡与溶酶体融合，通过溶酶体酶将被吞噬成分降解，然后自噬体膜脱落以再循环利用。细胞内的自噬活动在正常条件下处于较低水平，然而在多种诱导因素（如细胞因子、缺氧、缺乏营养等）的作用下可发生迅速增强。自噬实质上是细胞内消化大分子的过程，是自我保护的过程，其在肿瘤发生中的具体作用尚存在争议。自噬活动可有利于肿瘤细胞适应环境的变化，降低其凋亡。但是，研究发现在人类肿瘤中常存在自噬调节基因的突变，提示自噬有一定的抗癌效应[9]。研究发现，在多种人类肿瘤中均存在自噬活性的变化，且在同一肿瘤的不同阶段也存在着自噬活性的差异，提示自噬相关蛋白表达失调可能是一种新的肿瘤发生机制[10]。自噬在肿瘤治疗中的具体作用同样存在争议。肿瘤细胞可通过自噬对一些抗肿瘤方法产生抵抗；而另一些抗肿瘤方法可通过诱导自噬促进肿瘤细胞的死亡[11]。关于自噬究竟是抑制肿瘤的发生的屏障，还是肿瘤的适应性应答是现在研究的热点[12]。PCa的具体发病机制尚未完全阐明，其发生是遗传、环境因素共同作用的结果。有研究显示，自噬相关基因Beclin1在PCa患者中存在杂合性的丢失。而且，自噬能增加PCa对不同疗法（包括抗激素疗法、DNA损伤剂和放射疗法）的敏感度，提示自噬在PCa的发病中可能起到抑制作用[13]。自噬在PCa发生、发展中的作用方式备受关注，PCa和内分泌密切相关。研究发现，PCa中自噬和雄激素水平相关联，雄激素可对PCa细胞自噬发挥一定的调控作用，而通过调控自噬过程进而实现靶向性诱导PCa细胞的凋亡是一个具有研究潜力的治疗方向[14]。

Beclin1为酵母自噬基因Atg6/Vps30的同源基因，是自噬体形成过程中的一个必需因子，它可介导其它自噬蛋白定位于吞噬泡，进而调控自噬体的形成及成熟[15]。LC3为酵母自噬相关蛋白Atg8的同源体。LC3一般以可溶性LC3-Ⅰ的形式存在；当自噬发生时，LC3和自噬泡膜表面的磷脂酰乙醇胺结合，转变为脂溶性的LC3-Ⅱ。而LC3-Ⅱ的表达与自噬活性呈正比，是公认的自噬活性标记[16]。自噬过程受到自噬相关基因（Atg）的严格调控，而Atg5在自噬体形成过程中发挥关键作用[17]。在自噬体形成过程中，Atg5和Atg12结合，形成Atg5-Atg12泛素样连接系统，再和外膜结合以促进自噬体膜的延伸，最后形成自噬体[18]。本研究结果显示，PCa组织中 Beclin1、LC3-Ⅱ表达明显低于BPH组织，提示Beclin1、LC3-Ⅱ在PCa发生早期发挥抑癌作用。PCa组织中Atg5表达显著高于BPH组织，提示Atg5可能促进了PCa发生、发展。

Gleason评分因其与PCa的生物学行为及预后有良好的相关性，已得到广泛的临床应用，评分越高提示癌细胞分化和预后越差。研究发现，Gleason评分≥8分后切缘阳性率显著高于＜8分者[19]。PSA是早期筛查PCa的重要指标，其正常范围0～4.0ng/ml，大多数PCa患者血清PSA＞4.0ng/ml，但仍存在一定的假阳性和假阴性[20]。本研究进一步分析发现，Beclin1、LC3-Ⅱ的表达差异与Gleason评分、血清PSA水平、淋巴结转移、骨转移呈负相关；而与年龄无关。研究发现，Beclin 1、LC3-Ⅱ在PCa中阳性表达率明显低于正常前列腺增生组织，而两者在晚期PCa（C+D期）中阳性表达明显高于早期（A+B 期）[21]。有研究显示，Beclin-1、LC3-Ⅱ参与PCa的发生、发展；但Beclin-1、LC3-Ⅱ表达与Gleason分级无明显相关[22]。上述结果提示，Beclin1、LC3-Ⅱ在PCa的不同发展阶段发挥不同的作用。Atg5在PCa组织中表达明显高于BPH，但Atg5表达与Gleason评分、血清PSA水平、淋巴结转移、骨转移均无显著差异，与前期研究结果一致[23]，提示Atg5高表达可能是PCa变得前期分子时间，但其具体机制尚未明确。

综上所述，本研究发现自噬相关蛋白Beclin1、LC3-Ⅱ、Atg5在PCa组织中表达失调，提示自噬活动增强和自噬体形成增多在其发展过程中起着重要作用，进一步深入探讨自噬在PCa发病中的作用机制对开辟新的治疗途径有重要意义。