HPLC法测定痔疮外洗颗粒中盐酸小檗碱的含量

袁宏佳，郭洪明，梅 娇，刘兴文，姜 展

（重庆市北碚区中医院，重庆 410007）

痔疮外洗方为中华人民共和国卫生部部颁标准收载的散剂，是我院常用医院制剂，由芒硝、黄连、鱼腥草等组成，具有祛毒止痒、消肿止痛等功效，临床用于治疗痔疮漏疮、肛门痛痒疗效显著。方中黄连具有清热燥湿，泻火解毒的作用［1］。其主要有效成分为表小檗碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱等生物碱。参考相关文献［2-10］，选择盐酸小檗碱作为本试验的指标成分，并采用高效液相色谱法测定其含量，为痔疮外洗颗粒的质量控制提供依据。

1 仪器与试药

LC-20AT液相色谱仪（日本岛津），SPD-20A紫外检测器（日本岛津），LC-solution色谱工作站，色谱柱：InertSustain C18，5μm，4.6mm×250mm（日本岛津），十万分之一电子天平（瑞士梅特勒公司），SY1200T型超声仪（上海声源超声波仪器设备有限公司），PTK-R1-10L型实验室超纯水机（帕泰克）。

盐酸小檗碱对照品（中国药品生物制品检定所提供：批号713-9404），痔疮外洗颗粒（由北碚区中医院制剂室生产，批号：2017040-1，2017040-2，2017040-3），乙腈为色谱醇，水为超纯水，其余化学试剂为分析纯。

2 试验方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：InertSustain C18（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液（30：70）；流速：1.0mL/min；检测波长：345nm；进样量：10μL；柱温：30℃；理论塔板数按盐酸小檗碱峰计算大于15000。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取盐酸小檗碱对照品约16mg，置于100mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得浓度为160μg/mL的对照品溶液。再精密吸取对照品溶液0.5、1、2、4、8mL，分别置于10mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得盐酸小檗碱对照品稀释贮备液，并分别标记为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ。

2.3 供试品溶液的制备

称取痔疮外洗颗粒约2.5g，研细，精密称定，置于具塞三角锥形瓶中，加入甲醇-盐酸（100：1）的混合溶液50mL，密塞，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，用0.45μm微孔滤膜滤过，滤液即为供试品溶液。

2.4 阴性对照品溶液的制备

取方中药材（除去黄连）按痔疮外洗颗粒制备工艺同法制得缺黄连的阴性样品。再称取上述颗粒约2.5g，研细，精密称定，按“2.3”项下方法制备阴性对照品溶液。

2.5 方法专属性试验

精密吸取盐酸小檗碱对照品稀释贮备液Ⅰ、供试品溶液、阴性对照品溶液各10μl，分别注入色谱仪，按“2.1”项下色谱条件进行测定，得色谱图，详见图1。

图1（A为盐酸小檗碱对照品溶液 B为痔疮外洗颗粒样品溶液 C为阴性对照溶液）

盐酸小檗碱对照品保留时间在14分钟左右，供试品溶液在相应位置也检测到盐酸小檗碱的峰，而阴性对照品溶液在此保留时间无干扰。表明处方中其他药材不干扰盐酸小檗碱的含量。

2.6 线性关系考察

精密吸取对照品稀释贮备液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ各10μl，进样，按“2.1”项下色谱条件测定盐酸小檗碱峰面积（A），并以其为纵坐标，同时以盐酸小檗碱进样浓度（C）为横坐标，进行线性回归，得回归方程为A=39 129.4C+6 826.52，表明盐酸小檗碱检测浓度在8.447 5～135.16μg/ mL范围内线性关系良好（r=0.999 9）。

2.7 稳定性试验

取供试品溶液，按含测依法操作后，立即进样测定，并每隔一定时重复进样测定一次，持续6h，经统计学处理，盐酸小檗碱的峰面积积分值相对标准偏差RSD为1.37%，结果表明盐酸小檗碱在6h内基本稳定。

2.8 精密度试验

取供试品溶液，连续进样5次，测定其峰面积积分值，结果统计：盐酸小檗碱峰面积积分值的相对标准偏差RSD=0.07%。

2.9 重现性试验

取同一批号的痔疮外洗颗粒，依法重复操作测定5次，经统计学处理，测得盐酸小檗碱的平均含量的相对标准偏差RSD=1.21%。

2.10 回收率试验

采用加样回收法，取已知含量的同一批号样品，分别精密加入一定量的盐酸小檗碱对照品，依法操作进样测定，同法重复试验6次，测得盐酸小檗碱的平均回收率为100.04%，RSD=1.34%。

表1 加样回收率试验 （6次）

2.11 样品含量测定

精密称取不同批号的痔疮外洗颗粒2.5g，按“2.3”项下方法制备供试液，按“2.1”项下色谱条件精密进样10μl，测定。计算痔疮外洗颗粒中盐酸小檗碱含量，结果详见表2。

表2 样品的含量测定结果 （2次）

3 讨 论

本品处方由7味中药组成，而黄连为方中要药，大量文献报道盐酸小檗碱为黄连中的主要活性成分，具有显著的抗菌、消炎等作用。因此，选择黄连中的盐酸小檗碱作为含测指标成分，基本上能够达到控制质量的目的。参考有关文献含量测定方法［2-10］，并经多次实验条件摸索，选择了高效液相法测定本品中盐酸小檗碱的含量，具有方法灵敏、简便，分离度、重现性好的特点。

检测波长的选择。盐酸小檗碱对照品溶液在200～600nm进行光谱扫描，结果在345nm波长处制剂中盐酸小檗碱能有效分离，故选择345nm为检测波长。

参考相关文献［2-10］，确定以乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液为流动相，对流动相的不同比例进行考察，结果以乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液（30∶70）为最佳，基线平稳，盐酸小檗碱分离最好，保留时间适中（约14分钟）。

提取条件的选择。本实验采用水浴加热回流提取、超声提取、冷浸法分别对痔疮外洗颗粒进行处理，考察不同提取方式对盐酸小檗碱含量的影响。结果表明水浴加热回流提取与超声提取对于盐酸小檗碱的溶出量差别不明显，而冷浸法提取周期长，提取效率低，故从提取方法的简便性，提取效率方面考虑，最终选择超声提取方法。并且分别考察了用100%甲醇、50%甲醇、甲醇-盐酸（100∶1）的混合溶液对痔疮外洗颗粒进行处理，结果表明甲醇-盐酸（100∶1）的混合溶液提取效果最佳。而对于提取时间就分别考察了15min、30min、45min、60min对盐酸小檗碱含量的影响，结果表明随着时间的延长，盐酸小檗碱的含量无明显变化，故选择30min提取时间为宜。

HPLC法简单、快速、重现性好，可用于制剂的质量控制。