新合成材料PLGA-STPGS制备的大黄素纳米粒 诱导HepG2细胞凋亡

田 燕，刘 琦，张成鸿，高 萌，金 越，徐 红，李庆伟

(1. 辽宁师范大学生命科学学院，辽宁大连 116081；2. 大连医科大学药学院，辽宁大连 116044； 3. 大连医科大学基础医学院，辽宁大连 116044)

原发性肝癌是世界上癌症致死率排在第3位的恶性肿瘤[1-2]，但目前治疗肝癌的方法有限。采用纳米粒(nanoparticles, NPs)等靶向给药系统、提高化疗药物的靶向性是目前一种常见的肝癌治疗手段[3]。大黄素(emodin, EMO)是中药大黄、何首乌等的重要有效单体，具有抗菌消炎、肝脏保护、抗癌等药理作用[4-6]，但以EMO为主要成分并投入临床治疗的制剂较少，主要是因为其结构中含有较多的游离酚羟基、不稳定，又由于其在水中的溶解性较差、口服生物利用度较低，限制了其在临床中的应用。本研究将EMO制成纳米粒，通过材料的包载作用，可提高EMO的体外稳定性，并通过控制粒径大小使其被动靶向到肝脏，更好的发挥对肝癌的治疗作用[7]。

纳米粒载体材料的选择是制备纳米粒的关键因素之一，其中乙交酯丙交酯共聚物(polylactide-co-glycolide, PLGA)是目前研究和应用较为成熟的合成高分子材料，有可靠的生物相容性、无免疫原性及可生物降解、无毒性[8]。维生素E聚乙二醇1000琥珀酸酯(D-α-tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate, TPGS)是纳米粒制备过程中的高效乳化剂，有提高疏水性药物吸收、加强抗肿瘤药物的渗透性和吸收性等优点[9-10]。因此，本课题组将二者通过酯化反应合成新的高分子材料乙交酯丙交酯共聚物-琥珀酰基维生素E聚乙二醇1000琥珀酸酯(polylactide-co-glycolide succinyl-D-α-tocopherol polyethylene glycol 1000 succinate, PLGA-STPGS)，可通过控制纳米粒的粒径，实现所载药物对肝脏的被动靶向作用，由于TPGS是P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)的抑制剂及其较好的水溶性[10]，可使药物在肿瘤细胞中更好的发挥治疗作用。

本研究在此基础上，以EMO为模型药物，以PLGA-STPGS为载体材料，通过乳化溶剂挥发法制备大黄素PLGA-STPGS纳米粒(emodin-loaded PLGA-STPGS nanoparticles, EPTN)，并以市售材料PLGA为对照制备大黄素PLGA纳米粒(emodin-loaded PLGA nanoparticles, EPN)，测定二者粒径、载药量(drug loading, DL)和包封率(entrapment efficiency, EE)；选择人肝癌细胞HepG2为模型细胞，将2种NPs分别在体外与HepG2细胞孵育24 h和72 h，再用膜联蛋白V-荧光素异硫氰酸酯(annexin V-fluorescein isothiocyanate, Annexin V-FITC)/碘化丙啶(propidium iodide, PI)双染试剂盒和原位凋亡检测试剂盒(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated deoxyuridine triphosphate nick end labelling, TUNEL)检测凋亡的细胞，以评价EPTN在体外诱导HepG2细胞凋亡的效果。

1 材料与方法

1.1试剂大黄素(纯度97%，美仑生物公司，批号J0510A)；TPGS(MBWB1500，美国Eastman化学公司，批号：09060025)；PLGA(50∶50；MBWB40 000，山东省医疗器械研究所，批号：16042609)；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(江苏凯基生物技术股份有限公司，批号：20170519)；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(江苏凯基生物技术股份有限公司，批号：20161123)；其他所用试剂均为分析纯。

1.2细胞株人肝癌HepG2细胞购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心。

1.3仪器XS105DU电子天平(梅特勒托利多有限公司，瑞士)；Olympus CKX41荧光倒置显微镜(Olympus公司，日本)；TENSOR27傅立叶变换红外光谱仪(Fourier transform infrared spectrophotometer, FTIR，Bruker Optics公司，德国)；AVANCEIII HD1H-核磁共振光谱仪(1H nuclear magnetic resonance,1H-NMR，400M，Bruke公司，瑞士)；Milford凝胶渗透色谱仪(Gel permeation chromatography, GPC，Waters公司，美国)；NanoZS90激光粒径仪(Marlvern公司，英国)；BD FACSAria II流式细胞仪(Becton Dickinson公司，美国)。

1.4PLGA-STPGS的合成精密称取TPGS 300 mg(0.2 mmol)和丁二酸酐50 mg(0.5 mmol)于烧瓶中，加二氧六环溶解。加入一定量的4-二甲氨基吡啶(4-dimethylaminopyridine, DMAP)为催化剂，在60 ℃反应24 h。将产物加入适量石油醚产生白色沉淀，真空干燥48 h，得白色粉末为琥珀酰基维生素E聚乙二醇1000琥珀酸酯(succinyl-D-α-tocopherol polyethylene glycol 1000 succinate, STPGS)。精密称取PLGA 200 mg(0.005 mmol)和适量的STPGS(0.005 mmol)于烧瓶中，加适量二甲基甲酰胺(dimethyl formamide, DMF)溶解。用甲烷磺酸为催化剂，90 ℃反应24 h。将产物加入适量无水乙醇得到白色沉淀，并用纯化水反复洗至无反应物和溶剂残留，冷冻干燥24 h，得白色粉末PLGA-STPGS(合成过程见图1)。

1.5PLGA-STPGS的表征精密称取PLGA、TPGS与PLGA-STPGS各1 mg，分别用溴化钾100 mg压片，用FTIR法测定产物的红外光谱；同时以氘代氯仿(Chloroform-d, CDCl3)为溶剂测定3种聚合物的氢核磁共振谱(1H-nuclear magnetic resonance,1H-NMR)来确定产物的分子结构；采用GPC法测定PLGA-STPGS的数均分子量和分子量分布，流动相为四氢呋喃(tetrahydrofuran, THF)，流速为1 mL/min，进样量为50 μL[样品浓度为0.1%(W/V)]。采用差示扫描量热法(differential scanning calorimetry, DSC)评价3种聚合物的热性能，量取3种样品各5 mg置于铝坩埚中，以10 ℃/min的速度将温度从30 ℃逐渐升高到390 ℃进行测定。

1.6纳米粒的制备精密称取PLGA和PLGA-STPGS各100 mg，EMO 30 mg，用适量乙酸乙酯使其全部溶解，滴加到120 mL 0.5 g/L的TPGS水溶液中，在150 W超声条件下超声4 min，形成乳浊液。再将乳浊液于室温下600 r/min电动搅拌24 h，充分挥发乙酸乙酯后20 000 r/min高速离心15 min，然后将沉淀物用适量去离子水反复洗至上清液无EMO残留(将上清液吸出后滴加适量20 g/L的FeCl3水溶液至不显色为止)，每次均用20 000 r/min高速离心15 min，所得沉淀物再用少量去离子水分散均匀后冷冻干燥24 h，得淡黄色EPN及EPTN，4 ℃储存备用。以PLGA-STPGS为载体，同法制得不含EMO的白色空白纳米粒(blank PLGA-STPGS nanoparticles, BPTN)。

1.7纳米粒的表征

1.7.1粒径和ζ-电位的测定 称取干燥好的EPTN、EPN适量，用25 g/L的磷钨酸溶液进行负染，置透射电镜下观察2种NPs的形态特征。另称取干燥好的EPTN、EPN适量，超声分散后形成纳米粒混悬液，用激光粒度仪对其粒径、粒径分布和纳米粒表面的ζ-电位进行测定。

图1PLGA-STPGS的合成途径示意图

Fig.1 Illustration of the synthesis of PLGA-STPGS copolymer

1.7.2EMO色谱条件的建立 色谱柱为Kromasil ODS1(4.6 mm×250 mm，5 μm)，检测波长为287 nm，流动相为甲醇-0.5%冰乙酸溶液(90∶10)，流速为1.0 mL/min，柱温为30 ℃，进样量为20 μL。分别精密称取EMO原料药、对照品、EPN和EPTN适量，EMO溶解于甲醇中，EPN及EPTN溶解于乙酸乙酯中后用氮气吹干，再加入甲醇溶解定容至25 mL(质量浓度为12 μg/mL)，取适量进样。反相高效液相色谱图(reverse phase-high performance liquid chromatography, RP-HPLC)见图2，EMO的保留时间约为14.0 min，在此条件下，理论板数以EMO计不低于2 000，分离度符合要求。

图2大黄素反相高效液相色谱图

Fig.2 RP-HPLC images of EMO

A：EMO对照品；B：EMO原料药；C：EPTN；D：EPN。1：EMO。

1.7.3EMO标准曲线的绘制 精密称取EMO对照品10 mg，以甲醇为溶剂配制浓度为500 μg/mL的EMO对照贮备液。依次从中精密量取60、120、240、480、960 μL至10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，即得EMO系列对照品溶液(质量浓度为3.0、6.0、12.0、24.0、48.0 μg/mL)。按照1.7.2项下色谱条件，取EMO系列对照品溶液分别进样3次，以峰面积(A)对浓度(C)进行线性回归，得标准曲线方程：A=81.998 2C+54.568 1(r=1.000 0)。结果表明，EMO在3.0～48.0 μg/mL之间线性关系良好。

1.7.4载药量和包封率的测定 精密称取同一批号的EPN 2.1 mg和EPTN 1.4 mg各6份，按1.7.2项下操作，测定峰面积A，计算样品中EMO含量，再根据以下公式(1)、公式(2)计算EPN和EPTN的DL和EE。

公式(1)

公式(2)

1.8诱导HepG2细胞凋亡的测定选取对数生长期的HepG2细胞，胰蛋白酶消化后，调整细胞浓度(5×105/mL)后用6孔板培养细胞24 h。细胞贴壁后，吸去各孔培养液，以5-氟尿嘧啶溶液(5-fluorouracil solution, FS, 20 μg/mL)为阳性对照组，分别加入EMO浓度为20 μg/mL的EPTN、EPN混悬液、材料浓度为72.5 μg/mL的BPTN混悬液(与EPTN混悬液中PLGA-STPGS浓度相同)和EMO溶液(emodin solution, EMS, 20 μg/mL)，各组药物溶液均用无血清的H-DMEM培养基溶解、纳米粒均用无血清的H-DMEM培养基超声分散均匀，每组3个复孔。继续培养24、72 h后，分别收集每孔细胞并用冷的PBS缓冲液冲洗3次，重新分散在结合缓冲液(binding buffer)中使浓度为1×106/mL，按照试剂盒说明书操作，分别加入AnnexinV-FITC 5 μL和PI 5 μL，混匀，避光孵育20 min后，加入结合缓冲液400 μL，轻轻吹散细胞并用纱布过滤，立即用流式细胞分析仪分析细胞的凋亡特性。

将待测细胞接种于48孔板中(1×104/mL)并培养24 h，实验分为阳性对照组(加入TUNEL细胞凋亡试剂盒配备的DNA内切酶Ⅰ)、BPTN、FS组、EMS组、EPN和EPTN混悬液组，每组3个复孔，药物浓度及处理方法同上。继续培养24、72 h后，按照TUNEL细胞凋亡试剂盒说明书操作，37 ℃避光孵育30 min后，将所有孔内液体吸走，用冷PBS洗3次，每次5 min。将500 ng/mL的4′，6-二咪基-2-苯基吲哚(4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride, DAPI)100 μL加入到各孔细胞中，染色15 min。用PBS洗3次，每次5 min，立即在倒置荧光显微镜(fluorescence inversion microscope, FIM)下观察各孔细胞的凋亡情况。

2 结 果

2.1PLGA-STPGS的表征由IR结果(图3)可见，3种聚合物的主要吸收峰是在3 500～3 000 cm-1的OH键，在2 864～2 943 cm-1范围是-CH2键引起的吸收。三者在1 724 cm-1处均有羰基吸收，但因PLGA与PLGA-STPGS分子中有较多的乳酸和羟基乙酸基团，故羰基吸收峰强度远远大于TPGS的羰基吸收。另外，三者在1 191 cm-1附近均有C-O引起的伸缩振动峰，由FTIR光谱证明PLGA-STPGS是不同于PLGA和STPGS的新的共聚物。1H-NMR测定结果见图4。信号5.15 ppm和1.52 ppm(峰b和e)分别是PLA片段中-CH和-CH3，4.75 ppm(峰c)是PGA片段中CH2质子信号。3.78 ppm(峰d)是TPGS分子中聚氧乙烯片段上的-CH2信号。8.09(峰a)是聚乳酸片段中游离羧基-COOH上的质子信号。1H-NMR谱中PLGA-STPGS的数均分子量可以用质子信号分别在5.15(峰面积3.16)、4.75(峰面积6.44)和3.78 ppm(峰面积1.62)的峰面积比值进行计算，结果为24 114。PLGA和TPGS在整个聚合物中的比例分别为93.45%和6.55%。GPC测得PLGA-STPGS的数均分子量和分散度分别为25 347和1.42，与用1H-NMR测得的结果相似。PLGA和TPGS的熔融吸热峰分别为316 ℃和45 ℃，而PLGA-STPGS的熔融吸热峰为321 ℃(图5)。以上结果进一步表明，PLGA-STPGS与PLGA、TPGS不同，是一个新合成的高分子材料。

2.2EMO纳米粒的表征扫描电镜测定结果见图6，2种NPs均呈类球状或球状，表面圆整，且粒子大小均匀、粒子间分散无粘连。用激光粒度仪测定EPN的粒径、多分散系数(polydispersity index, PDI)、ζ-电位和DL、EE结果见表1。结果表明，以自制材料PLGA-STPGS为载体制备的EPTN比用市售材料PLGA制备的EPN粒径更小、分布更均匀，具有更大的DL和EE(P<0.05)。

图3PLGA、TPGS与PLGA-STPGS的IR图

Fig.3 FTIR spectra of PLGA, TPGS and PLGA-STPGS copolymer

2.3诱导HepG2细胞凋亡的情况

2.3.1Annexin V-FITC/PI试剂盒检测结果 流式结果如表2所示，FS组中细胞凋亡、坏死含量相对较低；而经EMS和载EMO纳米粒作用后，随着培养时间的延长，诱导产生的细胞凋亡率不断增加，呈时间依赖性。与EMS相比，EMO纳米粒诱导细胞的凋亡率更高，且EPTN的凋亡率大于EPN。细胞孵育24 h后，EPTN和EPN诱导细胞的凋亡率相比EMS的凋亡率(28.1%)分别提高了19.1%(P=0.042)和13.5%(P=0.046)，且相比FS的凋亡率(17.8%)分别提高了29.4%(P=0.029)和23.8%(P=0.031)；72 h后，EPTN和EPN诱导细胞的凋亡率相比EMS的凋亡率(30.9%)分别提高了31.5%(P=0.008)和21.2%(P=0.013)，且比FS的凋亡率分别提高了42.3%(P=0.006)和32.0%(P=0.009)。而空白纳米粒BPTN组与阴性对照组相似，当HepG2细胞与BPTN共同孵育24、72 h后，细胞的存活率均在97%以上，表明本研究中自制的高分子材料PLGA-STPGS对HepG2细胞无明显毒性和诱导其凋亡的作用。

图4PLGA、TPGS与PLGA-STPGS的1H-NMR图

Fig.41H-NMR spectra of PLGA, TPGS and PLGA-STPGS copolymer

2.3.2TUNEL试剂盒检测结果 以FS为对照，用TUNEL原位凋亡试剂盒检测2种NPs诱导HepG2细胞凋亡的结果如图7所示。阳性对照组中所有细胞核均被TUNEL标记呈绿色荧光，同时被DAPI标记呈蓝色荧光。与对照组相比，其他组细胞核均被DAPI标记呈蓝色荧光，但是其中只有凋亡的细胞核被TUNEL标记呈绿色荧光，而未凋亡的细胞核在该条件下不呈现绿色荧光。与EMS组相比，EMO纳米粒组中有更多的细胞核被TUNEL标记呈绿色荧光，EPTN组中细胞核被标记的最多。明场下观察，凋亡的HepG2细胞体积变小、形状变圆，部分核膜破裂。同样空白纳米粒BPTN组与HepG2细胞共同孵育24、72 h后，每孔中几乎观察不到被TUNEL标记的呈绿色荧光的细胞核，表明本研究中自制的高分子材料PLGA-STPGS对HepG2细胞无明显毒性和诱导其凋亡的作用。

图5PLGA、TPGS和PLGA-STPGS的DSC热吸收图

Fig.5 DSC heating thermographs of PLGA, TPGS and PLGA-STPGS copolymer

图6大黄素纳米粒的透射电镜图

Fig.6 TEM images of EMO-loaded NPs (×200 000)

A：EPN；B：EPTN。

表1EGPN和EPN的表征

表2AnnexinV-FITC/PI试剂盒检测HepG2细胞与BPTN、FS、EMS、EPN和EPTN孵育24h和72h后的凋亡结果

组别孵育时间(h)细胞比例(%)存活细胞凋亡细胞坏死细胞阴性对照组2497.9±1.91.8±0.60.3±1.07295.1±1.82.3±0.82.6±1.2BPTN组2498.2±1.20.8±0.41.0±0.57297.1±1.31.2±0.61.7±1.1FS组2458.9±3.017.8±1.323.3±2.47245.6±2.820.1±1.734.3±1.4EMS组2465.4±2.728.1±1.46.5±1.37258.3±2.730.9±1.810.8±1.3EPN组2450.8±2.441.6±2.2ac7.6±0.97237.5±2.352.1±2.6bc10.4±1.0EPTN组2446.7±2.2a47.2±2.1ac6.1±1.77224.9±2.2b62.4±2.6bd12.7±1.0

与相应的FS组比较，aP<0.05、bP<0.01；与相应的EMS组比较，cP<0.05、dP<0.01。

3 讨 论

本研究采用酯化方法直接以市售材料PLGA和TPGS为原料合成PLGA-STPGS，方法简单、成本低，所用的催化剂DMAP和甲烷磺酸催化效率高，中间体STPGS水溶性较好，故选择极性非常小的石油醚做沉淀剂能直接将其沉淀出来，PLGA-STPGS相对脂溶性较强，不溶于水和乙醇，而用无水乙醇做沉淀剂也能将其直接沉淀出来，所得产物产率高(83.9%)、纯度好。

多项研究证实，EMO能诱导多种肿瘤细胞凋亡[11-14]，尤其是在肝癌治疗中，EMO具有广谱的抗肝癌活性，能影响肝癌细胞的多种相关基因，能明显诱导肝癌细胞的凋亡[15]。本研究采用2种方法定量、定性地考察在诱导人肝癌细胞HepG2凋亡试验中，自制材料制备的EPTN是否具有比EMS和EPN更好的效果。通过预试验发现浓度大于20 μg/mL的EMO在48、72 h时引起HepG2细胞的坏死率较高，凋亡细胞较少，而EMO浓度低时，细胞存活率较高，均不利于试验结果的观察，故确定本研究的药物浓度为20 μg/mL。图7显示，载EMO纳米粒诱导的细胞凋亡率高于EMS(呈绿色荧光的细胞核更多)，这是因为纳米粒能被HepG2细胞直接摄取进入细胞内，不需要生物膜的转运过程，故能有大量的纳米粒进入细胞并在溶酶体的作用下释放出EMO，使其更好的发挥诱导HepG2凋亡的作用。同时，Annexinv-FITC/FI与TUNEL检测结果均显示EPTN有更高的细胞凋亡率，这是因为EPTN粒径更小、更容易被HepG2细胞摄取、进入细胞内的EPTN更多，EPTN载药量更大，所用材料PLGA-STPGS中TPGS具有良好的水溶性，随着材料本身在细胞内的降解，TPGS还可加快PLGA-STPGS的溶解，使EPTN中的EMO释放的更快、更完全，进而使更多的EMO在细胞内发挥药效。结果表明，本研究成功地合成了新的高分子材料PLGA-STPGS，并用定量、定性等方法证明了以PLGA-STPGS为载体制备的纳米粒EPTN能在体外诱导HepG2细胞产生更高的凋亡率。

图7TUNEL试剂盒检测HepG2细胞与阳性对照、BPTN、FS、EMS、EPN和EPTN孵育24h和72h后的凋亡效果

Fig.7 Apoptosis of HepG2 cells induced by positive control, BPTN, FS, EMS, EPN and EPTN after 24 h and 72 h of incubation timeinvitrousing TUNEL Apoptosis Detection Kit (×400)