重度子痫前期血清对滋养细胞中 组织因子的表达及甲基化的影响

2018-09-07 10:26田改彦王雯娟王慰敏
关键词:子痫甲基化重度

马 强,刘 睿,徐 娜,田改彦,王雯娟,王慰敏

(1. 西安交通大学第一附属医院周围血管科,陕西西安 710061;2. 南方医科大学附属佛山市 妇幼保健院妇科,广东佛山 528000;3. 西安交通大学第一附属医院妇产科,陕西西安 710061)

重度子痫前期为孕产妇常见的严重并发症,表现为高血压、蛋白尿和其他全身系统性的功能紊乱,死亡率高达15%,是国内及全球范围内引起孕产妇死亡的第二大病因[1]。在我国“二孩”政策开放后,随着高龄孕产妇基数的增加,重度子痫前期的发病率亦有上升趋势[2]。国内外诸多研究表明,妊娠期凝血功能异常导致的自身炎症-免疫通路激活可能通过损伤血管内皮细胞诱发重度子痫前期的发生[3-5]。组织因子(tissue factor, TF)是维持机体正常凝血功能的主要糖蛋白,且与孕早期滋养细胞的增殖分化及胎盘的形成密切相关[6]。我们前期研究发现,子痫前期患者胎盘中TF DNA启动子区域甲基化程度下调引起的蛋白表达增加在子痫前期的发病过程中起重要作用[7],主要从组织学水平证实了TF启动子区域甲基化程度与蛋白表达的相关性,尚缺乏细胞分子学水平的证据。因此,本研究拟在前期研究结论的基础上,探究重度子痫前期患者血清对滋养细胞HTR8/SVneo中TF的表达及其甲基化程度的影响。

1 对象与方法

1.1研究对象选择2017年1月1日至6月31日在西安交通大学第一附属医院妇产科就诊行剖宫产手术的孕妇,15名诊断为重度子痫前期妊娠孕妇为病例组,15名身体健康、足月妊娠孕妇为对照组。病例组平均年龄(28.25±4.13)岁,平均孕周(33.5±2.4)周;对照组平均年龄(26.32±3.57)岁,平均孕周(38.1±0.5)周。两组患者年龄差异无统计学意义(P>0.05),病例组分娩时平均孕周小于对照组,存在统计学差异(P<0.05)。所有研究对象均为自然妊娠的单胎孕妇,否认既往原发性慢性高血压病、肝肾疾病及其他内外科合并症病史,否认胎死宫内、胎儿染色体异常病史。对照组剖宫产指征均为相对头盆不称。排除吸烟、酗酒、辅助生殖技术受孕者等所有可能影响到孕妇甲基化的因素[7]。重度子痫前期诊断标准参照人民卫生出版社出版的《妇产科学》第8版[8]。本研究获得西安交通大学伦理委员会的批准,所有患者均充分知情并签署知情同意书。

1.2标本采集与处理收集孕妇剖宫产术前1日内外周血10 mL,置无菌离心管,37 ℃孵育2 h,2 500 r/min 离心40 min,收集上清液成分后用DMSO液冻存,置-80 ℃冰箱中保存备用。

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其次,创新管理机制。管理机制创新是指通过创新激励机制、惩罚机制、培训机制和竞争机制,进一步完善科研管理体制,完善科研评价体系,从而激励农业科技人员投身科研。不断创新管理机制,寻求科学、自动化和系统的管理。

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1.7统计学分析采用Graphpad Prism 5.0统计软件对数据资料进行统计学分析,计量资料采用(均数±标准差)表示,组间比较采用t检验;计数资料以例(或率)表示,用Fisher确切概率法进行检验,P<0.05为差异有统计学意义。

1.3细胞培养及处理将永生化的人滋养细胞系HTR8/SVneo细胞从液氮中取出复苏后,培养于含100 mL/L胎牛血清的DMEM培养基中,置于37 ℃、50 mL/L CO2细胞培养箱中孵育。将胰蛋白酶消化培养成功的滋养细胞,置于放有载玻片的24孔板中。分别向每个24孔板中加入浓度为20%的重度子痫前期和正常妊娠女性血清,在细胞培养箱中孵育24 h。孵育后的细胞置于培养箱中备用。

1.6HTR8/SVneo细胞中TFBSP甲基化测定以血液/细胞基因组DNA提取试剂盒(北京天根生物科技有限公司)提取重度子痫前期病例组和对照组HTR8/SVneo细胞基因组DNA,经紫外分光光度仪定量后,取2 μg DNA溶于去离子水中,加入10 μL新鲜配制的3 mmol/L氢氧化钠,37 ℃水浴40 min。模板上游引物序列5′-GAGGTAATTTAAAAGG-GTTGGAT-3′,下游引物序列5′-CCATCAATATA-CCAATCCAAAAC-3′,产物长度为389 bp。然后进行PCR扩增,扩增条件:95 ℃预变性5 min,95 ℃变性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共进行35个循环,末端延伸72 ℃ 5 min。割胶回收BSP产物,选用pMD19T作为载体进行连接,进一步转化感受态细菌后进行筛选、扩菌,提取质粒DNA后进行BSP测序。由西安东澳生物科技有限公司完成对所构建载体的测序。

1.5HTR8/SVneo细胞中TFmRNA表达的测定分别收集经过重度子痫前期及正常妊娠血清处理后的HTR8/SVneo细胞,采用Trizol法提取两组细胞中总的RNA,应用紫外分光光度计测定其纯度及浓度,参照Takara RNA PCR Kit(大连宝生物科技有限公司)试剂盒说明进行逆转录。将提出的RNA逆转录为cDNA放于-80 ℃冰箱备用。内参β-actin上游引物序列为5′-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3′,下游引物序列 5′-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3′。TF上游引物序列5′-TTCCTAAGCCTCCGGGATGT-3′,下游引物序列5′-CCGGGCTGTCTGTACTCTTC-3′;按照荧光定量PCR试剂盒反应说明书配制反应体系,将RNase-free H2O作为阴性对照组代替cDNA模板,加样至96孔板中,上Real-time PCR仪反应,反应条件为:预变性95 ℃,10 min 1个循环;PCR反应:95 ℃ 20 s,60 ℃ 1 min,72 ℃ 30 s共35个循环。根据扩增曲线可得到扩增产物达到设定阈值所经历的循环数(Ct),采用ΔΔCt的相对值分析两组细胞中TF mRNA的相对表达量。ΔΔCt法:A=Ct(目的基因,待测样本)-Ct(内标基因,待测样本),B=Ct(目的基因,对照样本)-Ct(内标基因,对照样本),K=A-B,表达倍数=2-K来表示测定结果。

1.4HTR8/SVneo细胞中TF蛋白表达的测定分别提取两组经过血清加氧处理后HTR8/SVneo细胞系中的总蛋白。用含PMSF的裂解液在冰上裂解30 min,BCA法测定蛋白浓度后-80 ℃冻存备用。取200 μg总蛋白上样,SDS-PAGE凝胶电泳、转膜、封闭、杂交,PVDF膜上滴加化学发光底物后,暗室内曝光显影,胶片晾干后拍照,使用Image J测灰度值,以目的蛋白条带与GAPDH条带灰度值比值作为目的蛋白的相对表达水平。

2 结 果

2.1HTR8/SVneo细胞中TF蛋白的表达Western blot定量检测发现,两组HTR8/SVneo细胞中均有TF蛋白的表达,且两组细胞中TF的表达水平组间比较存在差异,加入重度子痫前期组血清的细胞中TF蛋白表达量(0.932±0.039)显著高于正常妊娠血清组[(0.517±0.041),P<0.05,图1]。

图1HTR8/SVneo细胞中TF蛋白的表达

Fig.1 Expression of TF protein of HTR8/SVneo cells in the two groups

2.2HTR8/SVneo细胞中TFmRNA的表达qTPCR定量检测发现,加入重度子痫前期组HTR8/SVneo细胞中TF mRNA相对含量(1.48±0.27)显著高于加入正常妊娠血清组[(0.63±0.33),P<0.05,图2]。

2.3重度子痫前期血清对TF启动子区域甲基化的影响BSP测序结果显示,加入重度子痫前期血清的HTR8/SVneo细胞单链DNA中胞嘧啶(C-)均变为胸腺嘧啶(T-),呈现出去甲基化状态,未见蓝峰(图3A);而加入正常妊娠女性血清的对照组HTR8/SVneo细胞中TF基因组DNA的胞嘧啶(C-)仍然存在,显示其单链DNA中胞嘧啶呈甲基化状态,可见蓝峰(图3B)。

子痫前期是指既往基础血压正常的妊娠期女性在妊娠20周后出现高血压伴蛋白尿,为妊娠期特有疾病,与妊娠本身因素密切相关。我国子痫前期发病率约9.4%,死亡率约15%,居我国孕产妇死亡原因的第2位[1]。此外,子痫前期还是胎盘早剥、急性肾功能衰竭、弥漫性血管内凝血和循环衰竭等围产期致死性并发症的重要诱因[5]。重度子痫前期对孕产妇及胎儿带来的近远期危害更是不可估量。近年来,尽管对子痫前期有了较为深入的认识,但确切病因和发病机制尚未阐明。故探讨子痫前期的发病机制及其预测与防治,具有极其重要的意义和价值。新近研究认为,子痫前期是母体对妊娠的过度炎症反应,炎症反应使母胎界面免疫平衡失调,内皮细胞受损,胎盘血管病变,滋养细胞氧化应激、迁移受限与浅着床[4]。因此,炎症反应是子痫前期的重要病理基础。

图2病例组与对照组HTR8/SVneo细胞中TFmRNA的表达

Fig.2 Expression of TF mRNA of HTR8/SVneo cells in the case and control groups

3 讨 论

图6和图7显示了隧道开挖不进行支护时,隧道围岩的变形其力学特征的计算结果。水平位移图6(a)显示,围岩开挖后负方向位移最大负值为3 mm,且主要发生在仰拱区域,而正方向位移最大正值为18 mm,主要出现在第二条控制性结构面以外的区域;从图6(b)看出,在开挖X负向的位移沿第二条控制性结构面外侧发展,位移则出现在其内侧,拱顶外位移量最大;X正向位移出现在仰拱外。由图6(c)可知,总位移量最大也是出现在第二条结构面外侧和仰拱处。从图6(d)可以看出,隧道开挖后的位移矢量方向是指向隧道体,尤其是第2条结构面以外岩体的位移矢量方向更加明显,矢量最大值出现在第1条结构面以外岩体的拱顶位置。

子痫前期炎症过度激活,造成血管内皮细胞功能紊乱后会导致人体凝血功能的改变,以其损伤后TF大量表达和外源性凝血途径激活最为显著[3]。TF作为各种内源性及外源性凝血途径中的多能性调控蛋白,在子痫前期的发病过程中起重要作用[7],且国内外已有相关研究证实,组织学或血清学水平中TF表达失衡与子痫前期的发生发展密切相关,但具体机制尚不明确。近期研究发现,表观遗传学方面的调控诸如DNA甲基化、RNA甲基化,在平衡机体外周循环中TF的长期稳定方面有较为重要的意义[7]。有学者研究发现,人蜕膜自然杀伤细胞受体中TF的稳定表达要求建立在DNA甲基化基础上的表观遗传学修饰[9]。我们的前期研究发现,重度子痫前期患者胎盘中TF蛋白表达含量、mRNA水平均显著高于正常妊娠女性,而其甲基化程度则呈现下降趋势,且与蛋白表达水平呈统计学负相关,由此推测重度子痫前期患者胎盘中TF DNA启动子区域甲基化程度下调是导致其蛋白表达升高的主要机制之一[7]。但是,我们前期研究及国内外其他学者对TF和子痫前期发生之间的研究均局限于组织学方面,尚缺乏分子细胞水平的深入研究;且我们前期研究中采用的甲基化技术为PCR特异性的甲基化(MSP),仅作为定性研究方法,并非甲基化的金标准。故本研究在前期研究的基础上,从组织学水平进一步深入分子细胞学水平,将重度子痫前期妊娠孕妇外周血清加入滋养细胞中,观察其对组织因子的表达及其甲基化状态的影响。本研究采用了甲基化的金标准[10]——重亚硫酸盐的测序法(BSP)研究细胞中TF启动子区域的甲基化状态,较MSP更加准确且灵敏,有更强的说服力。

图3重度子痫前期血清与正常妊娠血清干预后TF在细胞基因组中DNABSP测序结果

Fig.3 BSP DNA sequencing result of TF in HTR8/SVneo cells between the case and control groups

A:病例组;B:对照组。

本研究结果显示,加入重度子痫前期患者血清的HTR8/SVneo细胞中,TF蛋白的表达和mRNA的表达均显著高于加入正常妊娠血清组,差异有统计学意义。这一点与我们前期在胎盘组织学水平的研究结果相一致[7]。此外,我们在细胞学水平研究亦发现,在加入重度子痫前期患者血清的HTR8/SVneo细胞中,BSP测序结果发现TF单链DNA上的胞嘧啶消失,取而代之的是胸腺嘧啶,而加入正常妊娠血清的细胞中仍可检测到胞嘧啶,说明仍存在甲基化状态,而重度子痫前期血清使TF DNA发生了去甲基化,这也进一步从细胞分子水平验证了我们前期的推测,并且与胎盘组织表观遗传学的结论相吻合。李蕴潜等[11]的研究发现,TF过表达会通过增加IL-4、IL-6、IL-8和MMP炎性因子的水平造成妊娠滋养细胞的功能异常,抑制滋养细胞的侵袭能力。当妊娠滋养细胞侵袭能力不足时,便会造成“胎盘浅着床”,使子宫螺旋动脉重铸不足,造成母-胎界面免疫失衡,继而诱发子痫前期的发生和进展[8]。

本课题在前期研究的基础上,进一步从分子细胞学水平探究了TF表观遗传学相关因素在重度子痫前期发病过程中的重要作用,较为详细地证实了组织因子启动子区域DNA甲基化水平下调对妊娠滋养细胞中TF表达的影响。这为进一步从表观遗传学角度预测重度子痫前期的发生以及相关靶向药物的研究提供了理论基础。下一步将通过寻找影响子痫前期患者TF甲基化调控的通路来深入研究造成其表观遗传学异常的可能机制。

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