吸烟者外周血单个核细胞差异表达 miRNA与mRNA调控网络

党晓敏，曲晓艳，尚 东，杨 岚，王维嘉，李 莹，李飞燕，常 颖

(1. 西安交通大学第一附属医院呼吸与危重症医学科，陕西西安 710061； 2. 西安交通大学前沿科学与技术研究院，生命科学与技术学院，转化医学研究中心，陕西西安 710054)

吸烟与多种疾病密切相关，包括多部位恶性肿瘤、呼吸系统疾病、心脑血管疾病、生殖和发育异常、糖尿病等[1]。研究表明，吸烟可影响免疫细胞功能[2]。微小RNA (microRNAs, miRNAs)是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其大小为20～25个核苷酸。通过与靶基因的3′ UTR区结合，miRNA能够抑制蛋白质翻译或降解mRNA，并可通过调控转录子和DNA甲基化来影响基因表达[3]，从而参与各种各样的调节途径，包括发育、病毒防御、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢等，而且在多种疾病中起着关键的作用，如癌症、病毒感染和肺部炎症性疾病等[4]。目前鲜有针对吸烟者miRNA表达谱的研究。本研究将利用高通量基因芯片手段检测非吸烟者和健康吸烟者外周血单个核细胞中miRNA和mRNA表达谱，并对差异表达的miRNA与mRNA之间的靶向关系进行预测分析，探讨其相关信号通路。

1 材料与方法

1.1研究对象从西安交通大学第一附属医院体检中心获得20名健康非吸烟者及17名健康吸烟者的外周静脉血。其临床指标如表1所示。志愿者均签署了相关协议，体检无癌症、糖尿病、心血管疾病和高血压等，无过敏史，近1月内无呼吸道感染病史，无皮质类固醇激素用药史。

表1非吸烟者与吸烟者的临床相关指标

临床指标非吸烟者吸烟者人数(n)2017年龄(岁)61.3±14.656.6±17.1男性/女性(n/n)12/817/0当前/曾经吸烟者(n/n)014/3吸烟量(包年)023.9±3.7BD后 FEV 1%预计值101.0±8.692.9±9.0

BD：支气管舒张剂；FEV1：1 s用力呼气量。

1.2主要试剂及仪器Ficoll-Paque PLUS试剂(GE Healthcare公司)；QIAzol裂解液、miRNeasy Mini Kit提取试剂盒(Qiagen公司)；Affymetrix GeneChip miRNA Array v.4.0、Affymetrix GeneChip®Scanner 3000(Affymetrix公司)；Agilent Human Gene Expression Microarray V4.0、Agilent Microarray Scanner System (Aligent公司)。

1.3RNA样本制备及基因芯片检测通过密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(peripheral mononuclear cells, PBMC)，利用miRNeasy Mini Kit试剂盒提取细胞总RNA，分别将非吸烟组和吸烟组中各RNA样本以等量RNA混合，用于基因芯片检测。委托北京博奥生物公司进行检测，分别采用Affymetrix GeneChip miRNA Array v.4.0和Agilent Human Gene Expression Microarray V4.0系统检测miRNA和mRNA表达谱。其中miRNA芯片包含30 424条探针，可检测2 588条人成熟miRNA。

1.4数据分析应用GeneSpring V11.5软件(Agilent公司)进行数据分析，表达差异大于2倍为候选基因，经Benjamini-Hochberg校正P阈值为0.05。应用TargetScan数据库对差异表达的miRNA靶基因进行预测，通过Cytoscape软件绘制调控网络图。通过Panther Classification System(http://pantherdb.org/)进行GO富集分析。

2 结 果

2.1吸烟者PBMC的miRNA差异表达对非吸烟者和吸烟者PBMC的miRNA表达谱进行分析(图1)，差异倍数大于2且荧光值差异在500以上的共有14条miRNA表达水平上调，5条下调(表2)。

表2吸烟者中差异表达的miRNA

Tab.2 Dysregulated miRNAs in the smokers

上调miRNA倍数hsa-miR-1273g-3p29.51hsa-miR-806915.35hsa-miR-150-5p14.57hsa-let-7b-5p11.89hsa-miR-448810.56hsa-miR-320b9.33hsa-miR-191-5p8.60hsa-miR-60886.80hsa-miR-28615.50hsa-miR-44664.65hsa-miR-1915-3p4.60hsa-miR-36563.85hsa-miR-77043.62hsa-miR-31962.07下调miRNA倍数hsa-miR-45300.27hsa-miR-6743-5p0.19hsa-miR-80750.10hsa-miR-6732-5p0.08hsa-miR-6750-5p0.04

2.2吸烟者mRNA差异表达对非吸烟者和吸烟者PBMC的mRNA表达谱进行分析(图2)，差异倍数大于2且荧光值差异在500以上的共有206个mRNA表达水平上调，190个下调，表3中列出了位于前10位上调和下调表达的基因。

2.3吸烟者PBMC中差异表达的miRNA与mRNA调控网络应用TargetScan数据库对吸烟者PBMC中差异表达的miRNA靶基因进行预测，绘制miRNA对mRNA调控网络图(图3、图4)。

图1非吸烟者和吸烟者PBMC的miRNA表达谱

Fig.1 miRNA profile of non-smokers and smokers

A：层次聚类图像；B：散点图，红色和绿色分别代表增高和降低的miRNA。

图2非吸烟者和吸烟者PBMC的mRNA表达谱

Fig.2 mRNA profile of non-smokers and smokers

A：层次聚类图像；B：散点图，红色和绿色分别代表增高和降低的mRNA。

2.4吸烟者PBMC差异表达基因GO富集分析对吸烟者PBMC差异表达基因的GO富集分析结果表明，核酸结合(nucleic acid binding)、信号分子(signaling molecule)、酶调节蛋白(enzyme modulator)、水解酶(hydrolase)、转移酶(transferase)、转运蛋白(transporter)、转录因子(transcription factor)是主要的蛋白分类(图5)。对通路的富集分析表明，血小板来源生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF)信号通路、胆囊收缩素受体(cholecystokinin receptor, CCKR)信号通路、T细胞活化(T cell activation)和表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)信号通路是主要的信号通路(图5)。其中富集涵盖的差异表达基因和相关miRNA见表4。

表3吸烟者中差异表达的mRNA

Tab.3 Dysregulated mRNAs in the smokers

基因名 称倍数吸烟者/非吸烟者功 能上调 CRISP2半胱氨酸丰富分泌蛋白2 4.06细胞外区域 LY96淋巴细胞抗原963.63脂多糖受体活力;Toll样受体信号(MyD88依赖和非依赖) MT1G金属硫蛋白-1G3.48单核细胞分化;血管内皮细胞生长因子应答 CD9CD9分子2.80血小板脱颗粒;细胞膜 LTF乳铁传递蛋白2.61铁转运 ANKFY1锚蛋白重复序列和FYVE结构域12.50内涵体;细胞内包膜细胞器;金属离子结合 PIGYY型磷脂酰肌醇聚糖2.49内质网 CD46CD46分子,补体调节蛋白2.47细胞膜;补体激活 MT1E金属硫蛋白1 E2.44金属离子结合;细胞生长负调节 UBA3泛素样修饰激活酶32.43ATP结合;蛋白质修饰;细胞周期;蛋白质水解下调 ATP13A3ATP酶13A3-8.43核酸结合;ATP结合;阳离子结合;ATP酶活性 PPP1R18蛋白磷酸酶1,调节亚型18-5.65肌动蛋白结合;细胞质;细胞骨架 RHBGRh家族,B糖蛋白-5.51铵跨膜转运体;细胞膜;细胞骨架 SARDH肌氨酸脱氢酶-5.20氨基甲基转移酶活性;线粒体 ZNF157锌指蛋白157-4.92RNA聚合酶Ⅱ启动子转录负调节;DNA结合转录因子活性 FTHL17铁蛋白,重多肽17-4.86铁离子转运,氧化还原酶活性 PKD1多囊肾病1(常染色体显性)-4.33胚胎发育;细胞周期阻滞 FLG丝聚蛋白-4.22钙离子结合;囊泡;中间丝 TERF2IP端粒重复序列结合因子2,相互作用蛋白-3.94端粒;NF-〠B通路正调控 VPS4B液泡蛋白分选4同源物(酿酒酵母)-3.92核内体;细胞分裂

图3吸烟者PBMC上调表达的miRNA对下调表达的mRNA的调控作用

Fig.3 The regulation of up-regulated miRNAs on down-regulated mRNAs in PBMCs of the smokers

图4吸烟者PBMC下调表达的miRNA对上调表达的mRNA的调控作用

Fig.4 The regulation of down-regulated miRNAs on up-regulated mRNAs in the smokers’ PBMCs

图5吸烟者PBMC差异表达mRNA的GO富集分析

Fig.5 The GO enrichment analysis of dysregulated mRNAs in the smokers’ PBMCs

表4吸烟者中差异表达的mRNA的GO富集分析

Tab.4 The GO enrichment analysis of dysregulated mRNAs in the smokers’ PBMCs

分类名称涵盖差异表达mRNA相关差异表达miRNA蛋白分类 nucleic acid binding核酸结合KLF13; TATDN2; CLIC4; KDM1B;SSRP1; BRD2miR-1273g-3p; -4488; -320b; -6088; -2861; -4466; -1915-3p; -8069; -3656; -8075; - 6750-5p; - 3196 enzyme modulator酶调节蛋白ARHGEF18; VAV3; PKD1;ARHGAP9; CASP8miR-1273g-3p; -4488; -1915-3p; -3196; let-7b-5p; miR-4466; -3656 hydrolase水解酶PLAU; MPPE1; LTF; CASP8; GNSmiR-2861; 6750-5p; -4530; -1273g-3p; -4488; -8069; let-7b-5p; miR-320b; -6088; -4466; -7704 transferase转移酶PIP4K2A; CS; CLIC4; BRD2miR-3196; -4488; -1915-3p; -8075; -1915-3p; -3196 transcription factor转录因子KDM6B; KLF13; SSRP1; RRN3miR-4466; -7704; -1273g-3p; -4488; -320b; -6088; -2861; -4466; -1915-3p; -1273g-3p transporter转运蛋白PKD1; GRIK2; NUP88miR-4466; -1915-3p; -3656; let-7b-5p; miR-4488; -2861; -4530; -6750-5p信号通路 PDGF signaling pathway血小板来源生长因子信号通路VAV3; ARHGAP9miR-1915-3p; -1273g-3p; let-7b-5p; miR-1915-3p CCKR signaling pathway胆囊收缩素受体信号通路PLAU; PKD1miR-1915-3p; -3656; -2861; -7704; -4466; -1915-3p T cell activationT细胞活化VAV3; HLA-DMBmiR-1273g-3p; let-7b-5p; miR-1915-3p; -1273g-3p EGFR signaling pathway表皮生长因子受体信号通路GAB3; PKD1miR-6750-5p; -8075; -3656; -7704; -4466; -1915-3p

3 讨 论

吸烟与多种疾病密切相关。本研究应用基因芯片高通量检测技术对非吸烟者与吸烟者外周血单个核细胞的miRNA与mRNA表达进行了分析，发现了吸烟者中差异表达的miRNA与mRNA，并对其调控关系进行预测分析，经GO富集分析表明差异表达基因中包括多类蛋白，并涉及多种信号通路。

本研究发现，吸烟者PBMC差异表达miRNA中，有多条miRNA被报道与疾病相关。miR-1273g-3p与肝硬化、糖尿病和肿瘤细胞迁移相关[5-7]；miR-4488在神经上皮肿瘤中表达上调[8]；miR-320b与冠心病相关[9]；血清miR-2861水平在冠状动脉硬化患者中增高[10]，而且miR-2861和miR-1915-3p在乳头状甲状腺癌发生淋巴结转移时表达增高[11-12]；结直肠癌患者的血清外泌体包裹的miR-8075水平降低，并可能参与了结直肠癌中的葡萄糖代谢[13]。提示吸烟可能通过引起相应的miRNA水平失调，进而对一些疾病的发生发展产生影响。

对在吸烟者PBMC中表达失调的miRNA与mRNA进行靶向关系预测，随后对相关基因进行GO富集分析，表明PDGF信号通路、CCKR信号通路、T细胞活化、EGFR信号通路是主要的信号通路。PDGF主要贮存于血小板颗粒，研究表明多种细胞可合成和分泌PDGF, 它是多种间质细胞如成纤维细胞、血管平滑肌细胞、肾小球血管细胞、神经胶质细胞等的强促有丝分裂剂和趋化因子，PDGF受体过度表达与肾小球肾炎、肝硬化、肺纤维化、动脉粥样硬化、血管病变、肿瘤等多种疾病相关[14-15]。在本研究中富集分析所涉及的PDGF信号通路蛋白包括VAV3和Rho GTP酶激活蛋白9(Rho GTPase activating protein 9，ARHGAP9)。Vav家族蛋白是Rho家族GTPase的鸟嘌呤核苷酸转移因子，在维持细胞形态、细胞粘附、血管生成、免疫功能的调节和细胞分化等过程中发挥重要作用。最近研究发现，VAV3的表达失调与肿瘤发生密切相关，提示VAV3具有原癌基因的活性[16]。ARHGAP9在上皮间充质转化、迁移和侵袭中起重要作用[17]。EGFR是ErbB家族成员之一，具有酪氨酸激酶活性，是一种重要的跨膜受体，EGFR被配体激活后调节转录因子激活基因的转录，指导细胞迁移、粘附、增殖、分化、凋亡，且与肿瘤的形成、恶化密切相关[18-19]。本研究中与EGFR通路相关的是GAB3和多囊蛋白1(polycystin 1, PKD1)。GAB3为生长因子受体结合蛋白2的接头蛋白，新近研究表明GAB3在神经胶质瘤中过表达并调控Akt活化和肿瘤细胞增殖。PKD1属于多囊蛋白家族成员，参与细胞-细胞、细胞-基质粘附和细胞间信号转导[20]。胆囊收缩素(cholecystokinin, CCK)是一种典型的脑肠肽，通过与其受体结合而发挥广泛的生物学作用，CCKR信号通路在消化道肿瘤中起重要作用[21]。T细胞活化则参与了多种疾病的发生发展，例如自身免疫性疾病、糖尿病、肿瘤等等。

综上所述，本研究首次对吸烟者PBMC的miRNA和mRNA表达谱进行分析，并筛选出差异表达基因进行靶向预测及信号通路分析，表明吸烟可导致与肿瘤、冠心病、糖尿病等相关基因的表达失调，提示吸烟可能是疾病发生发展的重要因素之一。