红树莓果酒澄清工艺的优化及理化指标的测定

夏天奇，高新亚，刘小琳，王 晴，王金玲*

（1.东北林业大学 林学院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.东北林业大学 工商管理学院，黑龙江 哈尔滨 150040）

红树莓（Rubus idaeusL.）为蔷薇科悬钩子属的木本植物，是一种药食同源的聚合浆果，因其富含花青素、黄酮、鞣花酸、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等天然活性成分，对癌症、肥胖[1]、糖尿病、心血管疾病、神经变性、黄斑变性、炎症损伤[2]等疾病有显著抑制作用，能有效预防衰老[3]，因此被列为世界第三代水果，已成为食品、保健品的研究焦点[4]，在化妆品、医药等方面有广泛应用价值。

红树莓果实出汁率较高，以其为原料酿制的果酒具有典型的树莓果香与发酵酒香，酒体丰满，是营养价值极高的低度保健酒[5]。而红树莓果酒中含有的果胶质、蛋白质[6]、色素、单宁等大分子物质，在加工、储存过程中易产生浑浊[7]，严重影响果酒的澄清度及品质。

澄清剂皂土吸水膨胀后，每克皂土约有750 m2的表面积，此外，皂土中硅氧四面体或铝氧八面体可形成负电性吸附中心[8]，因此，当皂土以溶胶的形式悬浮于果酒中时，可通过范德华力和负电荷作用吸附大量正电性蛋白质，铁、铜离子，色素和其他胶体粒子，通过沉降作用澄清果酒，同时提高果酒品质，增强果酒对铜破败病以及褐变的抵抗能力。MIHUCZ V G[9]等研究发现，在乙醇浓度12%和pH 3.56时皂土有最大澄清效果，适于偏酸性果酒的澄清。目前国内关于红树莓果酒的澄清研究主要有果胶酶[10]、复合澄清剂[11]两方面，而对皂土的系统深入研究鲜少。本研究采用皂土对红树莓果酒进行澄清处理，采用单因素及响应面试验优化澄清工艺，并探讨澄清前后果酒的酒精度、总糖、滴定酸、总酚、总黄酮、花色苷的含量变化，以期为红树莓果酒产业化生产奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红树莓果实：黑龙江省哈尔滨市售；葡萄酒果酒专用酵母、偏重亚硫酸钾、皂土（均为食用级）：帝伯仕法国进口；福林-酚试剂（分析纯）：天津市光复精细化工研究所；芦丁标准品（纯度99%）、没食子酸标准品（纯度98%）：上海源叶生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

722S可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；WNY-01酒精计：河北省沧州地区医药公司；PHS-26数显pH计：上海精密仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 红树莓果酒的制备工艺流程及操作要点

操作要点：

预处理：挑选新鲜、成熟度高的红树莓，去果蒂后漂洗，沥干。

调整成分：添加白砂糖调节发酵醪浓度至22°Bx，添加碳酸氢钠溶液调节发酵醪pH值为3.5～4.0。

接种：称取干酵母溶入10倍质量的白砂糖溶液（2%）中，30℃活化20～30 min，加入1%活化酵母。

主发酵：在23～25℃进行7 d的主发酵，发酵过程中及时进行搅拌，破坏发酵形成的泡盖，以便完全发酵。

倒罐：当糖度＜50 g/L，酒精度为10%vol～13%vol时，主发酵结束，将经过主发酵后的发酵醪用4层纱布过滤，倒罐装料率要大，酒液应接近罐顶，以减少罐内氧气，防止醋酸菌污染。

调整成分：补加白砂糖调节发酵醪浓度至20°Bx。

陈酿：20～22℃左右发酵15 d。

澄清：采用澄清剂法对果酒进行澄清。

杀菌：当产品在输送链上通过杀菌室时，130～160℃的过热蒸汽从上下喷射45 s。

1.3.2 分析检测

透光率（T）测定：取澄清后红树莓果酒的上清液，以蒸馏水为参比，在波长800 nm处测定透光率；吸光度值（A）测定：因透光率T/%=10-A，所以果酒透光率的变化趋势与吸光度值的变化趋势相反，同时测定果酒透光率和吸光度值可规避操作中的人为误差、环境因素及果酒成分变化对澄清度的影响，更准确的判断澄清剂浓度、温度、时间对果酒澄清度的影响。取澄清后红树莓果酒的上清液，以蒸馏水为参比，在波长610 nm处测定吸光度值；酒泥高度测定：于25 mL刻度比色管中根据刻度读取酒泥高度（澄清之后同时测定果酒的透光率、吸光度值、酒泥高度。测定之前不需要澄清处理，经过皂土澄清后的果酒，酒泥结构致密，沉积在瓶底，与酒体上清有明显分离界限。），酒精度的测定采用酒精计法[13]；残糖测定斐林试剂滴定法[13]；滴定酸度测定酸碱中和滴定法[13]；花色苷含量测定采用pH示差法[14]；总酚含量测定采用Folin酚法[15]，以没食子酸标准溶液质量浓度（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标，得到没食子酸标准曲线回归方程：y=0.016 0x+0.029 0，相关系数R2=0.999 3；总黄酮含量测定采用比色法[16]，以芦丁标准溶液质量浓度（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标，得到芦丁标准曲线回归方程：y=0.0118x-0.0013，相关系数R2=0.9991。

1.3.3 红树莓果酒感官评价

红树莓果酒感官评分标准见表1。感官评价请10位品酒专家（男性5名，女性5名），按澄清度（20分）、色泽（20分）、香味（30分）和滋味（30分）的评分标准进行打分，取10位专家打分的平均值作为最终得分，满分100分。

1.3.4 单因素澄清试验优化澄清工艺

表1 红树莓果酒感官评分标准Table1 Sensory evaluation standards of red raspberry fruit wine

1%皂土溶液的配制：精确称取1 g皂土，用10 g 50℃的热蒸馏水充分搅拌均匀，再加蒸馏水89 g，浸泡12～24 h，制成胶体悬浮液，在添加酒液之前再充分搅拌，以便于能够均匀的分布于酒液中[17]。

皂土添加量的确定：向红树莓原酒中添加1%皂土溶液使皂土终含量分别为0.01 g/L、0.02 g/L、0.03 g/L、0.04 g/L、0.05 g/L，在25℃条件下避光隔氧静置4 d，取上清液测定透光率、吸光度值，并读取酒泥高度[18]。

皂土澄清时间的确定：固定皂土添加量0.03g/L，在25℃条件下，避光隔氧静置2 d、4 d、6 d、8 d、10 d、12 d、15 d，取上清液测定透光率、吸光度值，并读取酒泥高度。

皂土澄清温度的确定：固定皂土添加量0.03g/L，分别在15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃条件下，避光隔氧静置4d，取上清液测定透光率、吸光度值，并读取酒泥高度。

1.3.5 响应曲面优化澄清工艺

为分析各个因素之间的交互作用对红树莓果酒透光率的影响，在单因素试验基础上，采用响应面分析法，以透光率（Y）为响应值，澄清温度（X1）、皂土添加量（X2）、澄清时间（X3）为考察因素，通过Design Expert 8.06设计3因素3水平试验，根据结果进行分析，并验证结果的可靠性。响应面优化因素与水平设计见表2。

表2 Box-Behnken试验设计因素与水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken experiments

1.3.6 数据处理与分析

每个试验均为3次重复，数据采用“平均值±标准差”表示，采用Excel 2010、Origin 8.0、Design-Expert 8.06、SPSS24进行分析处理并作图。

2 结果与分析

2.1 皂土澄清工艺优化的单因素试验

2.1.1 皂土添加量对澄清效果的影响

图1 皂土添加量对红树莓果酒澄清效果的影响Fig.1 Effect of bentonite addition on clarification effect of red raspberry fruit wine

由图1可知，皂土添加量在0.01～0.04 g/L范围内，吸光度值没有明显变化（P＞0.05），果酒的透光率及酒泥高度随皂土添加量增大而增加；皂土添加量为0.04 g/L时，果酒的透光率及酒泥高度均为最大，分别为95.5%、0.2 cm；皂土添加量＞0.04 g/L之后，透光率及酒泥高度减小。可能是由于皂土吸附能力达到平衡后，增加皂土添加量，因下胶过量而引起酒体浑浊。因此，选择最佳皂土添加量为0.04g/L。

2.1.2 澄清温度对澄清效果的影响

图2 澄清温度对红树莓果酒澄清效果的影响Fig.2 Effect of clarification temperature on clarification effect of red raspberry fruit wine

由图2可知，澄清温度在15～45℃范围内，红树莓果酒透光率和酒泥高度随澄清温度的增加先增大后减小；澄清温度在温度20℃时透光率和酒泥高度均为最大，分别为94.8%、0.36 cm；澄清温度＞20℃之后，皂土的架桥作用弱于胶体作用，澄清效果下降[19]，透光率和酒泥高度随澄清温度的增加逐渐减小。吸光度值随澄清温度的增加先减小后增大，并在澄清温度为20℃达到最小值。在温度20℃时酒体丰满，清澈透明，果香浓郁。因此，最佳澄清温度为20℃。

2.1.3 澄清时间对澄清效果的影响

图3 澄清时间对红树莓果酒澄清效果的影响Fig.3 Effect of clarification time on clarification effect of red raspberry fruit wine

由图3可知，红树莓果酒的透光率随澄清时间在2～15d范围内的增加先增大后减小，并在澄清时间6 d时透光率达最大，为94.8%，澄清时间＞6 d之后，透光率逐渐下降。酒泥高度随时间在2～15 d范围内的增加而逐渐增大，吸光度值随时间的延长先减小后增大。澄清6d后的红树莓果酒澄清透明，色泽光亮，酒泥致密。因此，最佳澄清时间为6 d。

2.2 皂土澄清工艺的响应面优化

在单因素试验基础上，采用Box-Behnken设计试验，设计3因素3水平响应面试验，以透光率（Y）为响应值，响应面试验设计及试验结果见表3。方差分析结果见表4。

表3 Box-Behnken试验设计结果Table 3 Design and results of Box-Behnken experiments

表4 响应面试验二次回归方程方差分析Table 4 Variance analysis of quadratic regression equation of response surface experiments

由表4可知，方差分析模型中P＜0.01，说明模型极显著，拟合精度好，可利用该响应面近似模型进行后续优化；失拟项P＞0.05，视为不显著，说明该模型在被研究的整个回归区域内拟合较好；模型决定系数R2=0.899 5，说明相关性较好，模型预测值能较好的反映实际值[20]。因此，回归方程符合检验原则，该模型合适，可以用此分析皂土添加量、澄清温度、澄清时间对红树莓果酒透光率的影响。模拟项的X1、X2、X12达到极显著水平（P＜0.01），X3、X22、X32对响应值无显著影响（P＞0.05），结合F值，可以看出各因素对于果酒透光率的影响顺序分别为：X1＞X2＞X3。拟合回归方程为：

以回归方程为依据，给制各参数间交互作用的三维空间响应曲面图，考察在皂土添加量、澄清温度、澄清时间中某一个因素固定为中心值时，其他两个因素的交互作用对红树莓果酒透光率的影响，结果见图4。由图4可知，响应面曲面图可反映各因素间的交互作用对响应值的显著程度，曲面越陡表示交互作用越强，曲面越平表示交互作用越弱。3个因素之间交互作用的强弱可以通过等高线形状直观反映出来，交互作用越明显，则等高线的椭圆越明显，反之就越圆。3个因素交互作用X1X2＞X1X3＞X2X3，与表4方差分析结果相符。

图4 皂土添加量、澄清时间及澄清温度对红树莓果酒澄清效果影响的响应面及等高线Fig.4 Response surface plots and contour lines of effects of interactions between bentonite addition,clarification time and temperature on clarification effect of red raspberry fruit wine

采用软件优化功能得出在所选试验因素范围，最佳试验条件为澄清温度21.27℃、皂土添加量0.04 g/L、澄清时间8 d，模型预测透光率95.60%。考虑到实际操作，选取最佳澄清条件为皂土添加量0.04 g/L、澄清温度21℃、澄清时间8 d。在此优化条件下进行3次平行验证试验，澄清后红树莓果酒透光率可达96.40%，与预测值非常接近，这表明该模型能较好地预测红树莓果酒澄清效果。

2.3 澄清剂处理对红树莓果酒理化指标的影响

红树莓果酒澄清前后理化指标的对比，结果见表5所示。

表5 红树莓果酒澄清前后理化指标对比Table 5 Comparison of physical and chemical indexes before and after clarification of red raspberry fruit wine

由表5可知，澄清度比未处理前提高了39.7%，总糖、滴定酸、酒精度、总酚、总黄酮、花色苷均有所下降。透光率、酒精度、总酚、总黄酮、花色苷澄清前后变化极显著（P＜0.01），感官评分变化显著（P＜0.05），总糖、滴定酸变化不显著（P＞0.05）。

澄清后果酒透光率相比原酒得到提高，花色苷、酚类物质、黄酮类物质的含量相比原酒降低。皂土在澄清过程中吸附酒体中的单宁，单宁的去除可减少果酒的酸涩感，口感醇厚，酸甜适中，果香与酒香协调，酒体呈玫瑰红色且澄清透亮，因此，相比原酒，澄清后果酒的感官评分明显提高。澄清后果酒的酒精度虽有下降，但维持在15.8%vol；红树莓果酒中的酸有原料带来的柠檬酸，也有发酵产生的醋酸、乳酸、丁酸、琥珀酸等，若含酸量适当，则果酒滋味醇厚、协调、适口，反之则差；澄清前后果酒中糖分变化不明显，对果酒口感无太大影响；澄清后果酒中总酚、黄酮、花色苷含量相比原酒虽有减少，但酒体中仍然保留有这些活性成分，并且通过澄清除去了一部分大分子胶体物质，使得果酒清亮透明，有光泽，无悬浮、沉淀和浑浊现象。

3 结论

本研究采用单因素及响应面试验优化了皂土对红树莓果酒的澄清工艺为皂土添加量0.04 g/L，澄清温度21℃，澄清时间8d。在此优化条件下，红树莓果酒透光率为96.40%，总糖含量7.13 g/L，酒精度15.8%vol，滴定酸度20.5 g/L，总酚含量0.83 g/L，总黄酮含量2.29 g/L，花色苷含量0.89 g/L，感官评分88分。澄清后果酒清亮透明，颜色酒红，酒体丰满，醇厚协调。