油樟、油樟寄生植物及桂花内生菌区系分布差异研究

张 萍， 马 鑫， 王 涛， 游 玲，2， 魏 琴，2

(1.宜宾学院生命科学与食品工程学院，四川宜宾 644000； 2.香料植物资源开发与利用四川省高校重点实验室，四川宜宾 644000)

植物生长的生态环境为内生菌的主要来源，已有大量研究揭示了其对植物内生菌的重要影响，如汪立群等用分离培养的方法，发现安徽的紫娟、云抗10号2种茶树的内生菌优势种属与季爱兵采用云南生长的同一品种样品得到的优势种属不一致[1-2]，说明不同生态环境中的同品种植物内生菌构成存在明显差异。王海采用PCR-DGGE和DNA测序技术发现相同产地川芎的内生真菌群落结构相似程度较高，不同产地间的相似程度较低[3]。近年来，高通量测序技术成为微生物区系研究的主要方法[4]，在植物内生菌研究领域也得到了广泛应用，证实环境对植物内生菌区系分布的影响比我们认识的更加重要。如Hong等发现九龙河口的多种湿地植物有着相似的优势内生菌[5]。马昭采用高通量测序及纯培养相结合的方法发现野生铁皮石斛内生菌的生物多样性和群落结构有别于人工栽培种，且各产地野生种铁皮石斛表现出各自独特的内生菌种群分布和群落结构特征[6]。赵维殳等也发现不同产地鱼腥草内生细菌的群落结构间有着明显的差异[7]。

油樟[Cinnamomumlongepaniculatum(Gamble) N. Chao ex H. W. Li.]属樟科(Lauraceae)，为国家Ⅱ级重点保护野生植物，主要用于樟油生产，四川宜宾为油樟的主产区，其枝叶中所含挥发油成分与其他产地的油樟有明显差异[8]，已经证实这些挥发性代谢产物的形成与其内生真菌有关[9]，表明油樟内生菌与宿主之间存在紧密联系。在野外调查中，笔者发现四川省宜宾县隆兴乡的油樟母本园的部分植株上着生有寄生植物，其枝叶完全没有油樟油特有的气味，由于该寄生植物与油樟生长环境、营养条件完全相同，仅植物基因型不一致，可作为研究宿主遗传特性(及其表型)对内生菌分布的影响的一种模型。因此本研究以油樟、油樟寄生植物及同一生长环境的乔木桂花为研究对象，探讨植物生长环境及遗传特性对内生菌区系分布的影响。

1 材料与方法

1.1 材料及来源

油樟、油樟寄生植物和桂花叶片均采自四川省宜宾县隆兴乡油樟母树繁育基地，基地地形为丘陵山地，面积21.67 hm2，林内均为胸径10～20 cm的油樟树，林下环境潮湿荫蔽，地面苔藓密集，植物种属较少，无其他乔木，仅边缘有桂花树零星分布。林中部分油樟树冠上着生有乔木类寄生植物，经查阅《中国植物志》[10]，并与四川大学植物标本馆中的相关植物标本比较，将油樟的寄生植物鉴定为桑寄生[Taxillussutchuenensis(Lecomte) Danser]。

采样地点海拔358.3 m，经度104.45°，纬度20.02°，时间为2016年1月下旬，采样时叶片处于生长完全阶段，少幼叶，按照多点采样方式，在油樟母本园方圆约200 m2范围里，分别选取3株长有桑寄生、无明显病虫害、胸径约15 cm油樟树及相邻50 m左右的3株桂花树，采集3种植物不同朝向、不同高度的叶片，分别混匀，马上送回实验室进行后续处理。

1.2 方法

1.2.1 叶片表面消毒 将刚刚采集的叶片用清水冲洗1 min使泥土洗净后，自然风干。75%乙醇浸泡60 s，后用无菌水冲洗叶片表面至少6次，最后1次无菌水取200 μL涂布PDA固体培养基，于28 ℃下培养，3～5 d内每天定时查看是否长菌。

1.2.2 提取叶片总DNA 采用Omega试剂盒提取叶片总DNA，按照试剂盒说明书操作。

1.2.3 PCR扩增 内生细菌扩增引物为338F(ACTCCTA-CGGGAGGCAGCAG)和806R(GGACTACHVGGGTWTCTAA-T)[11]，内生真菌引物为ITS1F(CTTGGTCATTTAGAGGAGT-AA)和2043R(GCTGCGTTCTTCATCGATGC)[12]。PCR反应体系为25 μL，PCR反应条件为95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，27个循环；72 ℃ 10 min。用3 μL上样、2%琼脂糖凝胶电泳检测产物，PCR扩增产物由上海美吉生物医药科技有限公司采用Illumina平台测序。

1.2.4 数据分析 过滤尾部质量值20以下的碱基及质控后50 bp以下的序列，再拼接，按最大错配比率为0.2，筛选不符合序列，对优化后的序列提取非重复序列，利用Usearch(vsesion 7.1 http：//drive5.com/uparse/)软件平台，按照97%相似性对非重复序列(不含单序列)进行OTU聚类，在聚类过程中去除嵌合体，得到OTU的代表序列，并绘制热图。利用silva数据库鉴定细菌种属[13]，利用Unite数据库鉴定真菌种属[14]，利用Mothur软件进行Alpha多样性分析，分别计算香农指数(Shannon)、Chao1指数、辛普森指数(Simpson)和物种丰富度指数(ACE)[15]，利用R软件制作Venn图。

2 结果与分析

2.1 序列质量分析

对细菌3个样品共测得序列120 401条，其平均序列长度为429 bp，其中420～460 bp的序列占99.97%，真菌 131 058 条，其平均序列长度为278 bp，其序列长度分布如图1所示。

2.2 内生细菌区系分布差异

从表1可以看出，油樟叶内生细菌的多样性最大，桑寄生次之，桂花最少。总体上，油樟叶片中内生细菌种类丰富，菌群结构较稳定，桂花叶片中虽有效序列条数最多，但菌群种类单一，菌群稳定性较差。

表1 3种植物叶内生细菌多样性比较

注：“GH”表示桂花，“JS”表示桑寄生，“YZJS”表示长有桑寄生的油樟。下同。

排除线粒体DNA，在属一级水平上，桂花内生细菌丰度大于1%的属有芽孢杆菌属(Bacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、Faecalibacterium、乳球菌属(Lactococcus)、嗜碱菌属(Alkaliphilus)、假丁酸弧菌属(Pseudobutyrivibrio)，其丰度分别为 8.02%、3.37%、3.37%、2.03%、1.39%、1.09%，其他丰度小于1%的种属合计共占3.17%。油樟内生细菌丰度大于1%的属有Bacillus、Enterococcus、Lactococcus、Alkaliphilus、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)下一个未鉴定属、 类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、海洋杆菌属(Oceanobacillus)，其丰度分布为40.19%、16.20%、11.89%、5.68%、4.42%、1.54%、1.38%，其他丰度小于1%的种属合计共占3.37%。桑寄生内生细菌丰度大于1%的属有Bacillus、Enterococcus、Lactococcus、Alkaliphilus、Enterobacteriaceae科下一个未鉴定属，其丰度分别为14.72%、5.46%、3.81%、1.72%、1.61%，其他相对丰度小于1%的种属合计共占1.8%。

从图2可以看出，油樟、桑寄生、桂花3种植物共有的细菌属有17个，独有的属分别仅有7个、1个、4个，表明3种植物的内生菌主要来源于环境，独有的这些属与这3种植物的遗传特性有关。有2个属仅在油樟、桑寄生中分布，表明这2个属与油樟、桑寄生相同的营养环境有关。

从图3可以看出，生长环境相同的桂花、油樟和桑寄生叶内生细菌的优势种属(相对丰度>1%)的构成及丰度不完全相同。与寄主植物油樟相比，桑寄生叶及桂花叶内生细菌的种属构成更为相似，除Pseudobutyrivibrio、Faecalibacterium、念珠菌属(Candidatus)仅在桂花叶内分布，莫拉氏菌属(Moraxella)仅在桑寄生叶内分布外， 其余各属在2种植物内的分布差异仅体现在丰度上，且梭菌属(Clostridium)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、Bacillus等优势属在桑寄生叶及桂花叶内的分布及丰度相似，但与桑寄生叶内生细菌相比，Candidatus仅分布于油樟叶内，Bacillus、Clostridium、Geobacillus、Lactococcus、Enterococcus在油樟叶内生细菌中的丰度也明显高于桑寄生，桑寄生与油樟叶内生细菌区系构成差异明显高于桑寄生与桂花。说明在相同环境背景下，植物内生细菌种属构成非常相似，但植物遗传特性对不同植物内生细菌的分布仍有2个方面的主要影响，一是不同植物内生细菌各种属的相对丰度不同，二是不同植物对某些种属细菌具有选择性。并且，相同的大环境及营养环境不能使油樟及其寄生植物拥有完全相同的内生细菌。考虑到寄主及寄生植物结构相互联通，内生细菌可自由迁移，有差异的种属来自种子垂直传播的可能性较小，更主要的原因可能在于植物遗传特性导致的叶内代谢产物不同， 而这些代谢产物在不同程度上调控着各种属内生细菌的生长。

2.2 内生真菌区系分布差异

从表2可以看出，油樟及桑寄生内生真菌的多样性明显高于桂花，其群落结构也更稳定。在属一级分类水平上，桂花内生真菌测得序列数量超过500条的属有未鉴定的子囊真菌属、未鉴定属、煤炱目(Capnodiales)下一个未鉴定属、镰刀霉属(Fusarium)、类担子菌酵母属(Derxomyces)、球腔菌科(Mycosphaerellaceae)下一个未鉴定属、瓶霉属(Phialophora)，其丰度分别为68.83%、6.61%、5.50%、5.48%、2.66%、2.24%、1.38%，测得序列条数少于500条的其他种属合计共占7.3%。油樟内生真菌测得序列数量超过500条的属有未鉴定的子囊真菌属、Mycosphaerellaceae科下一个未鉴定属、未鉴定属、平脐疣孢属(Zasmidium)、Capnodiales目下一个未鉴定属、散囊菌目(Eurotiomycetes)下一个未鉴定属、银耳目(Tremellales)下一个未鉴定属、考克娃酵母属(Kockovaella)，其丰度分别为42.18%、16.31%、13.25%、9.82%、7.97%、1.31%、1.15%、1.13%，测得序列条数少于500条的其他种属合计共占6.88%。油樟的寄生植物桑寄生测得序列数量超过500条的属有未鉴定的子囊真菌属、未鉴定属、Capnodiales目下一个未鉴定属、Derxomyces、Zasmidium、Mycosphaerellaceae科下一个未鉴定属、新拟盘乡毛孢属(Neopestalotiopsis)、假小尾孢属(Pseudocercosporella)、Phialophora，其丰度分别为50.43%、11.09%、9.92%、4.30%、4.27%、3.98%、2.52%、1.64%、1.39%，测得序列条数少于500条的其他种属合计共占10.46%。

从图4可以看出，桂花、油樟和桑寄生的共有属达188个，独有属分别仅有53、31、88个，且油樟及其寄生植物内生真菌共有属的数量不超过桂花与桑寄生内生真菌共有属的数量，表明在相同环境背景下，不同植物的内生真菌种属非常相似，完全相同的环境及营养条件并不能增加共有属的数量，造成不同植物内生真菌种属差异的主要原因仍是植物遗传特性。

从图5可以看出，同一环境中的桂花、油樟及其寄生植物的内生真菌主要优势种属均包括未鉴定的子囊真菌、未鉴定属、Teratosphaeriaceae科下一个未鉴定属、Capnodiales目下一个未鉴定属，表明这4个属的真菌主要来自其生长环境。

从聚类分析来看，与桂花相比，油樟和桑寄生的内生真菌区系构成更接近，体现在油樟及桑寄生内生真菌的主要优势属，包括未鉴定的子囊真菌属、Tremellales目下一个未鉴定属、Teratosphaeriaceae科下一个未鉴定属、Capnodiales目下一个未鉴定属及毛孢子菌属(Trichosporon)，其次，裂褶菌属(Schizophyllum)、长蠕孢属(Helminthosporium)、Kockovaella及1个未鉴定属的丰度均较为相近，但两者仍有22个属的内生真菌丰度差异较大，如青霉素(Penicillium)、掷孢酵母属(Sporobolomyces)只在油樟中分布，这些属可能与樟油的形成有关[7]，布勒掷孢酵母属(Bullera)、绿霉菌属(Metarhizium)、被孢霉属(Mortierella)只在桑寄生中分布，由于油樟及其寄生植物桑寄生除植物遗传特性不同外，生长环境及营养条件完全一样，因此，两者对上述种属内生真菌的选择性可能主要源于植物遗传特性。

3 讨论

从研究方法来看，本课题组曾采用培养法发现油樟优势真菌为组丝核菌属(PhacodiumPers.)和痂圆孢属(Sphacelomade Bary)[8]，与本研究采用高通量测序发现的油樟优势内生真菌明显不同，且由于避免了培养条件的选择性，使用该方法揭示的内生菌数量、种属都远远超过传统的纯培养方法[16-17]，表明在内生菌的多样性研究方面，高通量测序法能更加真实地反映植物内生菌的实际区系构成，但植物内生菌资源的开发利用仍需要结合传统的纯培养方法，以获得纯培养菌株或某种富集条件下的菌群。

从植物内生菌与环境的关系来看，同一环境的不同植物拥有高度相似的内生细菌及内生真菌种属，不同来源植物内生真菌区系构成差异较大，以桂花为例，卢东升等采用平板培养基诱导产孢分离得到桂花叶片4种优势种属大茎点霉属(Macrophoma)、链格孢属(Alternaria)、刺盘孢霉属(Colletotrichum)、拟茎点霉属(Phomopsis)[18]，而本研究中桂花优势种属则为未鉴定的子囊真菌、Tremellales目下一个未鉴定属、Teratosphaeriaceae科下一个未鉴定属、Capnodiales目下一个未鉴定属、Fusarium、Derxomyces，除研究方法的差异外，桂花来源的不同可能是造成其内生菌区系差异的主要原因，植物内生菌的区系构成与其生长环境具有非常密切的关系，脱离植物生长环境来研究某种植物的内生菌区系构成是不科学的，恰当的做法是将内生菌作为一个群体，研究其与宿主、环境的生态关系。在本研究中，3种具有迥异化学成分的植物，其内生菌区系构成却高度相似，可能是由于生长在相同环境的植物容易获得相似的内生菌，但这些内生菌中绝大多数与植物之间的联系较松散，无论是植物内部，还是外部的相邻环境，都仅仅是作为其适宜的居留地，仅有少数内生菌特别是内生真菌与植物之间存在不同程度的共代谢关系[19-20]。如诱导、激活植物形成某些活性代谢产物，同时这些代谢产物又反过来对内生菌的分布产生影响[21]，这在一定程度上解释了道地药材的部分成因[22]。本研究通过比较油樟、油樟寄生植物、油樟相邻乔木桂花内生菌区系差异，也从另一角度证实了生态环境对植物内生菌分布的重要影响，为植物生长的微生物生态环境保护提供了依据，也为植物内生菌资源的开发利用提供了重要参考。