百部汤对博来霉素诱导小鼠肺纤维化的抑制作用

谢伟娜，丁 奇，孙 静，张朝凤，张 勉，许翔鸿

(中国药科大学中药学院，南京 211198)

肺纤维化是各种内外致病因素引起肺脏受损后反复异常修复的结果，其病理改变主要表现为肺泡上皮细胞受损、肺间质细胞大量增殖和细胞外基质沉积增多[1]，发病机制复杂[2]。发病早期以肺泡炎为主，有大量炎性细胞浸润和多种细胞因子渗出，形成慢性肺间质性炎症；慢性炎症导致肺成纤维细胞活化增殖，使细胞外基质过度沉积、组织结构改变，肺组织逐渐变硬，患者肺功能受损直至呼吸衰竭[3]。近年来，由于环境恶化，间质性肺疾病的发病率逐年增高[4]，但长期以来无药可医。2014年10月，美国FDA批准吡非尼酮和尼达尼布用于特发性肺纤维化的治疗[5]，也只能延缓肺纤维化发展的进程。肺纤维化在中医中多归于“肺痿”范畴，中医在治疗“肺痿”方面具有历史悠久的方药和经验，临床上已显示出独特的治疗优势[6]。

中药百部为百部科植物直立百部(StemonasessilifoliaMiq.)、蔓生百部(S.japonicaMiq.)或对叶百部(S.tuberosaLour.)的干燥块根[7]，收载于历版《中华人民共和国药典》，具有镇咳祛痰、平喘、杀虫等传统功效，含有百部的复方制剂被广泛应用于治疗各种慢性肺疾病如肺纤维化、慢性阻塞性肺疾病等[8-9]。百部汤为载于《本草汇言》(明·倪朱谟)的治疗肺痿的古方，其组成为百部、薏苡仁、百合、麦门冬各三钱，桑白皮、白茯苓、沙参、黄耆、地骨皮各一钱五分，用于治疗久嗽不已、咳吐痰涎、重亡津液、渐成肺痿。由于对叶百部分布较广，蕴藏量和产量均较高，已成为目前市场上百部的主流品种。因此，本文主要研究对叶百部为君药组成的百部汤对博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化的影响。

1 材 料

1.1 药品与试剂

百部药材样品S1、S2分别于2014年9月购于河北安国，样品S3于2016年11月购于广西桂林，经本文作者鉴定均为对叶百部S.tuberosa的干燥块根。薏苡仁、百合、麦冬、桑白皮、茯苓、沙参、黄芪和地骨皮2016年8月购于南京颐和药店，经本文作者鉴定分别为薏苡Coixlacryma-jobivar.mayuenStapf.的种仁、百合Liliumbrowniivar.viridulumBaker的肉质鳞叶、麦冬Ophiopogonjaponicus(L.f.) Ker-Gawl.的块根、桑MorusalbaL.的根皮、茯苓Poriacocos(Schw.) Wolf的菌核、珊瑚菜GlehnialittoralisFr.Schmidt ex Miq.的根、蒙古黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.) Hsiao的根和枸杞LyciumchinenseMill.的根皮。凭证标本均存放于中国药科大学生药学研究室。注射用盐酸博来霉素(海正辉瑞制药有限公司)；水合氯醛(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；尼达尼布(上海煜柯化学品有限公司)；羟脯氨酸试剂盒(南京建成生物工程研究所)；其他试剂均为市售分析纯。

1.2 仪 器

高效液相色谱：Agilent 1200分析型液相色谱。低温高速离心机、旋转蒸发仪、冷冻干燥机(日本Eyela公司)；酶标仪(美国BioTek公司)；AL104型电子天平(上海天平仪器厂)；BX51型显微镜(日本Olympus公司)。

1.3 动 物

清洁级ICR小鼠，雄性，4～8周龄，由南京青龙山动物繁殖场提供，实验动物生产许可证号：SCXK(苏)2017-0001。喂养于中国药科大学动物中心。动物于(24±2)℃分笼饲养，自由饮食饮水，动物室采用12 h光照和12 h黑暗的光暗周期，动物在实验室适应环境1周后进行实验。实验前禁食12 h，自由饮水。所有动物实验均符合动物伦理委员会标准。

2 方 法

2.1 百部汤的制备

称取百部、薏苡仁、百合和麦冬各10 g，桑白皮、茯苓、沙参、黄芪和地骨皮各5 g，加8倍量水或70%乙醇回流提取1 h，滤过，药渣再加4倍量水或70%乙醇回流提取0.5 h，滤过，合并滤液，减压挥去溶剂，即得百部汤浸膏(BBT)。为了保证实验效果的可重复性和可比性，除百部样品(S1～S3)外，其余八味药材均为同一批次。由百部样品S1组成的百部汤水提取物浸膏得率为22.3%；由百部样品S1、S2、S3组成的百部汤70%乙醇提物浸膏得率分别为19.7%、18.5%和17.8%。将浸膏混悬于CMC-Na制成0.5 g/mL(生药量)的溶液，即浸膏浓度分别为112 mg/mL(S1-BBT水提物)、99 mg/mL(S1-BBT醇提物)、93 mg/mL(S2-BBT醇提物)和89 mg/mL(S3-BBT醇提物)，备用。

2.2 模型制备及给药方法

小鼠腹腔注射4%水合氯醛(10 mL/kg)麻醉，仰卧固定于实验台上，经气管软骨环间隙向气管内缓慢注入生理盐水溶液(假手术组，Sham)或博来霉素溶液(3.5 mg/kg)。注射后迅速将小鼠直立并旋转，使药液在肺内均匀分布。造模后第1天(预防给药)或第8天(治疗给药)开始，连续14 d每天1次灌胃给予BBT(5 g/kg，生药量)，以尼达尼布(30 mg/kg)为阳性对照，假手术组和模型组给予等量CMC-Na溶液；给药体积为0.1 mL/10 g体重。小鼠灌胃给予BBT的剂量经预实验(5、10、15 g/kg，其中10 g/kg为小鼠换算剂量)确定。

2.3 肺组织标本采集

第22天小鼠称重后摘眼球取血处死，迅速开胸分离肺脏，用预冷的生理盐水快速洗净组织表面，剔除残余支气管及结缔组织，吸干表面生理盐水后称重，计算肺系数。小鼠左上肺叶用于羟脯胺酸含量测定，左下肺叶于4%福尔马林中固定用于制作组织切片。其他肺叶冻存于-80 ℃冰箱备用。

2.4 肺组织病理切片制作和羟脯氨酸含量测定

小鼠肺组织于4%福尔马林中固定24 h后制作H&E或Masson染色切片。H&E染色切片由专业人员阅片评分，根据病变和炎症程度由轻到重标记为0、0.5、1、2、3分。Masson染色切片采用积分光密度数值(IOD，integrated optical density)半定量估算胶原的含量，即每张组织切片选取上、下、左、右和中间五个视野进行拍照，再用Graphpad Prism 5.0数据分析软件对每个照片进行胶原积分，求其平均值，即为该组织切片的胶原积分。胶原羟脯胺酸含量按照试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：A030-2)所附说明书进行测定。

2.5 HPLC-ELSD色谱条件

色谱条件：Agilent Extend C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)及Agilent预柱，流动相为0.1%三乙胺-甲醇(43∶57)，流速1 mL/min，进样量10 μL，柱温30 ℃；ELSD漂移管温度80 ℃，氮气流速2.1 mL/min，增益为8。

2.6 统计学分析

3 结 果

3.1 百部汤醇提物和水提物抗肺纤维化作用的比较

传统百部汤是水煎液，但是化学成分分析结果显示，醇提物比水提物成分多、含量高，因此采用博来霉素诱导的肺纤维化小鼠，采用预防给药的方式，对百部汤水提物和醇提物的抗肺纤维化效果进行了比较研究。

实验结果如图1所示。肺纤维化小鼠的存活率是评价肺纤维化治疗效果的重要指标之一。给药14天后，各组小鼠的存活率如图1-A所示。与假手术组小鼠(100%)相比，模型组和百部汤水提物组小鼠的存活率均为50%，百部汤醇提物组和阳性药的小鼠存活率分别为90%和80%，提示醇提物和阳性药可显著降低小鼠死亡率，而水提物则无明显改善作用。从小鼠体重来看，与模型组相比，假手术组和醇提物组小鼠的体重明显上升，而水提物组小鼠体重无明显改变(图1-B、1-C)。肺系数是评价实验性肺水肿及肺纤维化的常用指标，模型组小鼠肺系数显著增高，给药组小鼠肺系数均有下降的趋势，但仅百部汤醇提物和阳性药显著降低了小鼠肺系数(图1-D)。羟脯氨酸是评价组织纤维化中胶原纤维的常用指标，模型组小鼠肺组织中羟脯胺酸含量显著升高，给药组小鼠肺组织中羟脯胺酸含量均不同程度地下降，百部汤醇提物的效果略优于水提物(图1-E)。小鼠肺组织H&E染色结果(图1-F)显示，假手术组小鼠肺组织结构正常，模型组小鼠肺组织内成纤维细胞增生明显，肺泡壁有炎细胞浸润或肺泡炎，肺泡腔内出现单核巨噬细胞，肺泡壁有以单核巨噬细胞为主的炎细胞浸润，肺泡壁有不同程度的塌陷，表现为肺组织实变，肺泡腔消失，肺内支气管上皮细胞有轻度或中度变性，排列不整齐。与模型组相比，给药组小鼠的病变程度均有所减轻，其中百部汤醇提物的效果最为明显，肺组织炎性评分结果(图1-G)显示，仅百部汤醇提物对博来霉素引起的炎症具有显著性的改善作用，阳性药尼达尼布也不能显著改善炎症，说明抗炎不是其抗肺纤维化的机制。小鼠肺组织Masson染色结果(图1-H)显示，模型组小鼠肺组织有大量的胶原沉积(蓝色)，给药组的胶原沉积均明显减少，百部汤醇提物效果优于水提物；肺组织胶原半定量结果(图1-I)显示，百部汤醇提物和水提物均可显著抑制胶原的沉积，但醇提物的效果更为显著。综上，百部汤醇提物的抗肺纤维化效果优于百部汤水提物，因此采用百部汤醇提物继续进行后续实验。

3.2 不同化学型对叶百部对百部汤抗肺纤维化作用的影响

百部是传统的润肺止咳中药，其主要的活性成分为百部生物碱类化合物。目前市场上流通的百部主要为对叶百部(S.tuberosa)的块根。已有研究表明，不同产地、不同批次的对叶百部中生物碱类成分变异较大，根据其所含的主要成分可将对叶百部分为主含新对叶百部碱(neotuberostemonine)、对叶百部碱(tuberostemonine)、百部新碱(stemoninine)和金刚大碱(croomine)4个化学型[10-11]。因此本课题组在对不同批次对叶百部成分分析的基础上，选择了3个以单一生物碱为主成分的对叶百部药材(含金刚大碱的药材与其他生物碱共存，故未选)，采用治疗给药的方式，研究不同化学型对叶百部组成的百部汤对肺纤维化的作用是否存在差异。

Figure1 Effects of ethanol extract and water extract fromBaibuTangon bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice

A:Survival rate of mice (n=10);B,C:Body weight of mice (n=5 - 10);D:Lung index (n=5- 10)；E:Content of hydroxyproline (n=5- 10);F,H:Representative sections of lung tissue stained by HE (F) or Masson′s trichrome (H) (n=5);G:Inflammatory score (n=5);I:Values of integrated optical density (n=5)

BBTst:Water extract;BBTct:Ethanol extract;Nib:Nintedanib

*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001vsthe model group

3.2.1 3个对叶百部药材样品化学成分的比较 对3个对叶百部药材样品S1～S3的化学成分采用HPLC-ELSD方法进行了分析，结果如图2所示。经与对照品对照，样品S1色谱图中保留时间为20.07 min的主峰为新对叶百部碱，说明该药材主含新对叶百部碱；样品S2色谱图中保留时间为21.28 min的主峰为对叶百部碱，说明该药材主含对叶百部碱；样品S3色谱图中保留时间为9.91 min的主峰为百部新碱，说明该药材主含百部新碱。HPLC色谱分析结果表明了样品S1～S3主含不同的生物碱成分，为3个不同化学型的对叶百部，其中新对叶百部碱和对叶百部碱为立体异构体。

Figure2 HPLC chromatograms ofBaibu(root ofStemonatuberosa) samples S1-S3 and the chemical structures corresponding to the main peaks

1:Neotuberostemonine;2:Tuberostemonine;3:Stemoninine

3.2.2 不同化学型对叶百部为君药的百部汤抗肺纤维化作用的比较 分别由S1、S2和S3组成的百部汤(BBTs1、BBTs2、BBTs3)对博来霉素诱导的肺纤维化小鼠的影响如图3所示。给药14 d后，各组小鼠的存活率如图3-A所示，与假手术组小鼠(100%)相比，模型组小鼠的存活率为60%，阳性药为70%，而BBTs1、BBTs2和BBTs3各组小鼠的存活率分别为100%、90%和80%，略有差异。与模型组小鼠相比，BBTs1、BBTs2、BBTs3给药小鼠的体重均有显著性增加且相互之间无差别(图3-B、3-C)；虽然BBTs2可显著降低小鼠肺系数，从肺系数的平均值看，三者差别不大(图3-D)。三种不同化学型对叶百部组成的百部汤均能明显降低模型小鼠肺组织中羟脯氨酸的含量，其中BBTs3的效果略优于BBTs1和BBTs2(图3-E)。小鼠肺组织HE染色结果(图3-F)显示，模型小鼠肺组织出现了明显的病变，BBTs1、BBTs2、BBTs3给药后均可减轻小鼠的病变程度，肺组织炎性评分结果(图3-G)显示，BBTs1和BBTs2对博来霉素引起的炎症具有明显的改善作用，且BBTs1效果略优于BBTs2，BBTs3具有改善的趋势但无显著性差异。小鼠肺组织Masson染色结果(图3-H)显示，模型组小鼠肺组织胶原沉积(蓝色)明显，百部汤各给药组小鼠肺组织中胶原组织均明显减少，胶原积分光密度数值(图3-I)均明显下降，且抑制程度相似，说明不同主成分对叶百部的百部汤均具有明显抑制小鼠肺纤维化的作用。

综上，不同化学型对叶百部为君药的百部汤均具有显著的抗肺纤维化作用，但对小鼠肺组织病理学改变和炎症的影响略有差异，需要进一步的研究。

4 讨 论

肺纤维化属于纤维增殖性疾病的范畴，其病变主要累及肺间质，也可累及肺泡上皮细胞及肺血管，以肺成纤维细胞的异常增生和胶原蛋白为主的细胞外基质过度沉积为主要表现，至今发病机制不明，且没有理想的治疗方法。随着污染加剧、环境恶化等因素，肺纤维化在全球的发病率呈不断上升的态势，已成为严峻的健康问题[12]。由于肺间质性疾病最终均发展为肺纤维化，因此对肺纤维化发生机制和有效药物的研究具有非常重要的意义。

Figure3 Effects ofBaibuTangwithBaibu(root ofStemonatuberosa) containing different components on bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice

A:Survival rate of mice (n=10);B,C:Body weight of mice (n=5-10);D:Lung index (n=5-10);E:Content of hydroxyproline (n=5-10);F,H:Representative sections of lung tissue stained by HE (F) or Masson′s trichrome (H) (n=5);G:Inflammatory score (n=5);I:Values of integrated optical density (n=5)

BBTs1:BaibuTangwithBaibumainly containing neotuberostemonine;BBTs2:BaibuTangwithBaibumainly containing tuberostemonine;BBTs3:BaibuTangwithBaibumainly containing stemoninine;nib-nintedanib

*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001vsthe model group

中医药古籍中并无“肺纤维化”一词，根据其临床症状，中医常将其归为“肺痹”或“肺痿”，且多认为“肺痹”为肺纤维化的中早期阶段，“肺痿”为中晚期阶段[13-14]。百部汤为治疗“肺痿”的古方，因此本文对百部汤的抗肺纤维化作用进行了研究。结果发现，百部汤的水煎液和醇提物均具有干预肺纤维化的作用，但醇提物效果优于水提物。LC-MS分析结果表明，百部汤的主要活性成分为百部生物碱和薏苡仁油脂类化合物(将另文发表)，二者均为小极性化合物，为上述药效学实验结果从物质基础的角度提供了依据。

百部为始载于《名医别录》的常用中药，归肺经，具有润肺下气、止咳的作用，为中医治疗肺纤维化常用的组方药物。我们的前期表明，对叶百部总生物碱及从对叶百部中分得的单体化合物新对叶百部碱均具有明显的抗肺纤维化作用[15-16]。百部为百部汤复方的君药，由于对叶百部化学成分变异较大，因此本文又进一步研究比较了3个不同化学型(分别主含新对叶百部碱、对叶百部碱和百部新碱)的对叶百部组成的百部汤对博来霉素诱导的小鼠肺纤维化的影响。实验结果表明，虽然不同化学型百部药材组成的百部汤对肺纤维化小鼠不同病理指标的影响程度略有差异，但均具有显著的抑制羟脯氨酸、改善肺组织胶原沉积的作用，且其活性强度相似。这说明了只要是正品的对叶百部，不论其含有什么类型的生物碱(不同的化学型)，由其组成的百部汤均具有明显的拮抗肺纤维化的作用。从化学结构上来看，样品S1主含的新对叶百部碱和样品S2主含的对叶百部碱为立体异构，而样品3主含的百部新碱与上述两个化合物的结构差异较大。本论文的研究结果提示，这3个化合物可能都具有抗肺纤维化的活性。新对叶百部碱的抗肺纤维化活性已被证实[17]，对叶百部碱和百部新碱的活性正在进一步的研究中。

由于市场上难于收集到直立百部和蔓生百部药材，因此本文未能比较不同植物来源百部对百部汤抗肺纤维化作用的影响。