碱性药物在硫醚嵌入苯磺酸硅胶固定相上的色谱行为

王晓欢, 陈磊

(天津大学药物科学与技术学院, 天津 300072)

随着新药的不断开发,药物分子呈现出更为复杂多样的化学结构和性质,对复杂药物的分离分析提出了更高的要求。高效液相色谱(HPLC)作为一种有效的分离手段在药物分析方面的应用越来越广泛。反相色谱(RPLC)以其对疏水性化合物较强的选择性和灵敏度,在药物分析中应用广泛。但其对强极性和离子型化合物的保留较弱,在分离碱性化合物时常导致峰形拖尾、柱效和重复性变差[1]。离子交换色谱(IEC)常用于分离可解离或离子型化合物,但对于带相同电荷而疏水部分有差异的化合物分离度较差[2]。离子对色谱(IPC)克服了以上困难,通过在流动相中加入离子对试剂,增加了离子型化合物在反相色谱中的保留,能够同时分离中性和离子型化合物[3]。然而由于离子对试剂的引入造成柱平衡时间较长,并且与质谱不兼容,不适用于梯度洗脱和制备纯化,这些缺陷都限制了IPC在分离分析中的广泛应用。

模仿IPC与离子型化合物的多种作用,混合模式色谱(MMC)依靠表面的多功能基团,在不使用离子对试剂的情况下,能够实现复杂样品的分离[4-6]。反相/离子交换色谱(RP/IEC)因其高度的正交性,是开发和研究最多的混合模式色谱,在核苷酸及蛋白质分离[7,8]、药物杂质检测[9-11]、代谢研究[12]、天然产物分离纯化[13,14]等方面得到了广泛的应用。

近年来,关于混合模式色谱制备和应用的报道很多,但对其保留机理的系统研究却很少且存在争议[15-19]。这是由于RP/IEC键合多种功能基团,溶质的保留受反相和离子交换两种作用的影响[19,20],使得其色谱保留机理变得更复杂。最初,研究人员通过考察反相色谱上碱性化合物与疏水链和解离硅羟基的作用来探讨RP/IEC的混合保留机理。Yang等[15]研究了碱性化合物在C18和聚丁二烯修饰二氧化锆(PBD-ZrO2)两种固定相上的保留机理,在不同盐浓度流动相中,观察一系列对烷基苄胺同系物的色谱行为,认为两个固定相上反相和离子交换两种位点单独起作用。Neue等[17]提出了三种作用形式的保留模型,表明除上述两种单独作用外,还存在两个位点的同时作用,称之为反相协同的离子交换作用,并且该作用对带电碱性化合物在C18固定相上的保留具有重要影响。Zhang等[18]探讨了几种碱性化合物在反相/弱阳离子交换色谱(RP/WCX)上的保留行为,采用反相和离子交换两种作用形式保留模型,考察了流动相中不同类型反离子的影响。综上所述,对于RP/IEC混合模式色谱的保留机理,多数研究者更倾向于两种位点单独作用的保留模型,而忽略了协同作用的影响。

巯基-烯点击化学反应[21,22]具有条件温和、简单高效、反应可控、产率高等优点,在色谱固定相修饰方面具有潜在优势。本文通过巯基-烯点击化学反应键合苯磺酸(单配体)或同时键合苯基和苯磺酸(双配体)得到两种硫醚嵌入型反相/强阳离子交换(RP/SCX)混合模式固定相。在混合模式色谱条件下,分离了4种强碱性药物,系统考察了其在不同流动相条件下的保留行为。探讨了三种作用形式保留模型的合理性,进行了定量分析,揭示了反相/离子交换协同作用的重要影响,为混合模式色谱固定相设计和分离条件的优化提供了重要的理论依据。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Vario Micro Cube元素分析仪(德国Elementar公司),安捷伦1100高效液相色谱分析仪,配G1322A脱气机、G1311A四元泵、G1329A自动进样器、G1329A柱温箱、G1314B紫外检测器和ChemStation色谱工作站(美国安捷伦公司)。

球形硅胶(粒径:10 μm,比表面积:292 m2/g,平均孔径:10 nm,天津市倍思乐色谱技术开发中心),巯丙基三甲氧基硅烷(MPTMS,纯度98%,湖北武大有机硅新材料股份有限公司),对苯乙烯磺酸钠(SS,纯度99%,上海源叶生物科技有限公司),苯乙烯(St,纯度99%,天津市大茂化学试剂厂),三乙胺(TEA)、甲醇、无水乙醇和乙腈(纯度均为99%,天津市康科德科技有限公司),偶氮二异丁腈(AIBN)、正己醇、四氯化碳和正己烷(纯度均为99%,天津市光复精细化工研究所),硫酸沙丁胺醇、盐酸普鲁卡因胺、盐酸可乐定、盐酸普萘洛尔和盐酸阿米替林标准品(纯度均为99%,中国药品生物制品检定所)。

1.2 RP/SCX混合模式固定相的制备

RP/SCX混合模式固定相的制备途径如图1所示。以球形多孔硅胶为原料,经气固相硅烷化反应得到巯丙基修饰的硅胶中间相;再经巯基-烯点击化学反应键合上疏水链和磺酸基,得到RP/SCX固定相。典型步骤如下:称取4 g酸化后的硅胶微球于聚四氟乙烯反应釜中,加入1.8 mL(9.6 mmol)MPTMS和1 mL(7.2 mmol)TEA,于150 ℃马弗炉中反应8 h。反应结束后依次用甲醇、甲醇-水(1∶1, v/v)、甲醇洗涤,于80 ℃真空干燥过夜,得到巯丙基硅胶微球(MPS)。将4 g MPS微球和80 mL甲醇分散于150 mL反应瓶中,然后加入0.04 g(0.24 mmol)AIBN, 0.165 g(0.8 mmol)SS和184 μL(1.6 mmol)St,振荡溶解,通氮气除氧后密封,放于70 ℃恒温水浴摇床中震摇12 h,过滤,依次用甲醇、甲醇-水(1∶1, v/v)、甲醇洗涤,80 ℃真空干燥过夜,得到苯基和苯磺酸修饰的双配体混合模式固定相(Ph/BS)。和上述合成途径相同,用SS代替SS和St的混合物,得到苯磺酸修饰的单配体混合模式固定相(BS)。

图 1 Ph/BS固定相合成路线图Fig. 1 Synthesis route of phenyl/benzenesulfonate (Ph/BS) stationary phaseTEA: triethylamine; AIBN: azobisisobutyronitrile; MeOH: methanol; MPS: mercaptopropyl silica.

1.3 色谱柱的装填

采用高压匀浆法装柱。称取适量微球样品,超声均匀分散于正己醇-四氯化碳混合溶液(1∶1, v/v)中,在30 MPa的压力下,以正己烷为顶替液,将固定相填充到150 mm×4.6 mm不锈钢柱管中。

1.4 色谱条件

流动相:乙腈-50 mmol/L KH2PO4(50∶50, v/v, pH 3.0),检测波长:220 nm,流速:1.5 mL/min,柱温:30 ℃。

2 结果与讨论

2.1 RP/SCX混合模式固定相的表征

图2为MPS和Ph/BS填料的红外谱图。可以看出,与MPS相比,Ph/BS显示出较强的苯环特征吸收峰。其中,700和580 cm-1处分别为苯环碳氢的面外弯曲振动峰和苯环骨架的伸缩振动峰。1 082 cm-1处为硅氧键的伸缩振动峰,在1 500 cm-1附近Ph/BS较MPS明显变宽,这是由于与磺酸基相连的苯环的伸缩振动引起的。2 939 cm-1处为苯环上的碳氢伸缩振动峰,与巯丙基侧链上亚甲基的碳氢伸缩振动峰重叠,使得峰强增加。综上表明,苯基和苯磺酸基团已成功键合在Ph/BS固定相表面。

图 2 巯丙基硅胶微球(MPS)和Ph/BS填料的红外谱图Fig. 2 IR spectra of MPS and Ph/BS packings

采用元素分析仪对混合模式色谱填料进行定量表征,结果如表1所示。根据文献公式[23],巯丙基和苯基的表面覆盖率(αMP和αPh)通过碳含量计算,苯磺酸的表面覆盖率(αBS)通过硫含量计算。结果表明,通过气固相反应得到了较高的巯丙基键合量,Ph/BS和BS固定相表面的苯磺酸键合量基本相同,且Ph/BS固定相上成功键合了苯基基团。由于两种混合模式固定相都是在同一批巯丙基硅胶上键合的,所以它们色谱行为的差异可以归结为修饰的功能配体不同。

表 1 巯丙基硅胶微球和混合模式固定相的元素分析

αMP: surface coverage of mercaptopropyl groups;αPh: surface coverage of phenyl groups;αBS: surface coverage of benzenesulfonic acid.

2.2 分离碱性药物

在药物分析中,碱性药物的色谱分离一直是被关注的热点。由于碱性基团的解离,碱性药物在反相色谱和离子交换色谱分离过程中拖尾严重,这与硅胶表面残余硅醇基导致的“二级解离平衡”有关[1]。为避免这种效应,常需要选择酸性条件,抑制硅醇基解离(pKa为5～7)。因此,本文制备了两种以苯磺酸(pKa=-2.8)[24]为离子交换基质的RP/SCX混合模式固定相,以期在低pH条件下使碱性化合物获得较好的峰形并提高分离的选择性。选择沙丁胺醇(pKa=9.4, logP=1.69, logP为油水分配系数)、普鲁卡因胺(pKa=9.2, logP=3.00)、可乐定(pKa=8.05, logP=3.11)和普萘洛尔(pKa=9.42, logP=3.77)4种结构差异较大的强碱性药物作为探针,对其在不同流动相条件下的保留行为进行了研究。

考察了温度对溶质的色谱保留行为的影响,发现从20 ℃增加到60 ℃,溶质的保留时间明显缩短。但温度较低时,由于溶质传质变慢,峰形展宽,使得柱效较低;温度较高时,几种溶质的分离度变差,尤其是在BS固定相上碱性药物会发生严重的重叠现象,而且高温会降低色谱柱的稳定性和缩短其使用寿命。因此,综合柱效、保留和稳定性3方面考虑,选取30 ℃进行碱性药物的保留机理考察。

图 3 碱性药物保留因子(kT)对流动相pH作图Fig. 3 Plots of retention factor (kT) vs. mobile phase pH for basic drugsa. BS phase; b. Ph/BS phase.

2.3 pH的影响

流动相pH影响碱性化合物的解离程度,从而改变其在混合模式固定相上的保留。保持流动相中盐浓度和有机相比例不变(50 mmol/L KH2PO4-乙腈(50∶50, v/v)),改变pH,考察其对碱性药物保留行为的影响。从图3a可见,在pH 3～10范围内,碱性药物在BS固定相上均得到较好的保留。由于苯磺酸的pKa为-2.8,在此过程中均处于完全解离状态。在pH 3条件下,出峰次序为沙丁胺醇<普鲁卡因胺<可乐定<普萘洛尔。除可乐定外,在pH 3～8之间,随流动相pH的增加,另外3种碱性化合物的保留逐渐增加,在pH=8时保留最强。这是由于硅胶表面的硅醇基解离程度增加,与碱性药物间发生了离子相互作用,从而导致保留增加。当pH>8时,碱性药物的保留迅速减弱,是因为高pH条件下碱性物质的解离受抑制,与磺酸基间的离子相互作用减小,主要靠反相作用保留。可乐定的pKa比其他3种碱性药物小,所以在pH>6时即出现解离被抑制的现象。从图3b可见,在Ph/BS固定相上,碱性药物的保留随pH改变呈现相同的趋势。但与BS固定相相比,在整个pH考察范围内,碱性药物在Ph/BS上的保留更强。在高pH条件下,普鲁卡因胺和普萘洛尔在BS固定相上共出峰,而在Ph/BS上却能得到较好的分离。这说明疏水性苯基的存在对化合物的保留和分离有重要的影响。

2.4 离子强度的影响

依据离子交换理论,流动相中缓冲盐影响离子型化合物与固定相间的离子相互作用。对于单纯离子交换色谱,单价离子溶质的保留与流动相中的反离子浓度呈反比[15]:

(1)

其中,kIEX代表单纯离子交换保留因子,[C+]代表流动相中单价反离子浓度(mmol/L),BIEX代表离子交换常数,BIEX与固定相的离子交换容量、溶质与固定相间的离子交换平衡常数及相比有关。

保持流动相的pH和有机相比例不变(pH 3.0 KH2PO4-乙腈(50∶50, v/v)),考察了离子强度对碱性药物保留行为的影响。从图4可见,在两个固定相上,随盐浓度减小,碱性药物的保留增强,并且保留因子与盐浓度的倒数均呈很好的线性关系,说明在固定相上存在离子交换作用。根据公式(1),如果只存在单纯的离子交换作用,截距应为0。从表2可见,两个固定相的截距都大于0,说明还存在其他作用。

图 4 碱性药物kT对流动相中盐浓度倒数作图Fig. 4 Plots of kT vs. inverse buffer concentration for basic drugs a. BS phase; b. Ph/BS phase.

对于RP/IEC混合模式色谱,多数研究者[15,16]认为,溶质的总保留因子(kT)受反相作用(保留因子kRP)和离子交换作用(保留因子kIEX)的独立影响,用公式(2)表示:

(2)

Neue等[17]提出,除这两种单独作用外,还存在反相协同离子交换作用(简称协同作用,kRP/IEX)。基于自由能叠加原理,kRP/IEX可以表示为k*RPk*IEX,因为协同作用中的反相和离子交换与单纯的反相和离子交换不一定相同,故加星号以区分。因此,总保留因子kT可以表示为以下关系:

kT=kRP+kIEX+k*RPk*IEX=

(3)

根据公式(2)和(3),不管协同作用是否存在,总保留因子与盐浓度的倒数都呈正比,并且截距代表反相保留。由表2可知,在两个固定相上,沙丁胺醇的截距最小，普萘洛尔的截距最大。由于沙丁胺醇和普鲁卡因胺logP较小,所以在两个固定相上的截距差别比较小;而对于疏水性较强的可乐定和普萘洛尔,在Ph/BS固定相上的截距比BS固定相上的截距大,说明疏水性苯基增加了固定相的反相保留。由于两个固定相的苯磺酸键合量基本相同,单纯离子交换作用近似一致。然而观察斜率发现,对于相同溶质,在Ph/BS固定相上的斜率比BS固定相上的斜率明显增加,并且反相作用越强的碱性药物斜率相差越大。这说明斜率与其反相作用有关,因此公式(3)中的三种作用形式的保留模型更适合于RP/SCX混合模式色谱的保留行为研究。

表 2 碱性药物kT对盐浓度倒数作图的截距、斜率和相关系数(r2)

kRP: retention factor based on reversed-phase retention.

根据公式(3),kT减去kRP可以求得单纯离子交换和反相协同离子交换两种离子交换作用的总保留值(kIEX+k*RPk*IEX)。从表3可见,在两个固定相上,随着盐浓度增加,碱性药物的kRP保持不变,总离子交换作用(kIEX+k*RPk*IEX)减小。Ph/BS固定相与BS固定相相比,同一溶质在相同条件下,kRP差别不大或增加,但是总离子交换作用增加更为明显,对于反相作用最强的普萘洛尔,其总离子交换作用增加将近一倍。另外,在两个固定相上都是总离子交换作用占主导,除沙丁胺醇外,其他3种碱性药物在Ph/BS固定相上的总离子交换贡献反而比BS固定相强。以上现象说明Ph/BS固定相上增加苯基,一方面提高了固定相的反相保留行为,另一方面明显增强了协同效应,使得总离子交换的保留和贡献增加。原因可能是:在BS固定相上,当碱性药物同时与苯磺酸自身的反相和离子交换基团作用时,才有协同效应;而在Ph/BS固定相上,协同作用还可以发生在磺酸基和邻近的苯基之间,这种协同作用对碱性药物的保留和选择性有很大的影响。因此,除了可以改变不同的流动相条件外,还可以通过调节双配体中离子基团和疏水基团的比例来设计不同类型的固定相,以满足不同的分离需求。

表 3 碱性药物在BS和Ph/BS固定相上各作用保留值及总离子交换贡献(T)

kIEX: retention factor based on ion-exchange retention;k*RPk*IEX: retention factor based on hydrophobically assisted ion-exchange retention (cooperative retention).

2.5 有机溶剂强度的影响

维持流动相pH 3和整个体系总离子强度25 mmol/L不变的情况下,仅改变流动相中乙腈的比例(体积分数为35%～50%),考察有机溶剂强度的影响。从图5可见,随流动相中乙腈比例增加,碱性药物的保留明显减小,这与大多数溶质在反相色谱中的保留行为一致。

在反相色谱中,对于有机相和水相的二元混合体系,在一定的有机溶剂强度范围内,反相保留与有机溶剂体积分数(φ)的关系符合线性溶剂强度理论(LSS)[25]:

logkRP=logkW-Sφ

(4)

logkRP代表溶质在反相色谱中的保留值;logkW代表溶质在纯水相条件下的保留,与固定相的疏水性有关;S表示斜率(大小与流动相组成和溶质有关)。

从图5可知,4种碱性药物的logkT对φACN作图没有呈现很好的线性关系,而是都表现为向下凹的曲线。在其他有关混合模式的文献[26,27]中也观察到了这种弯曲现象。原因是,在RP/SCX混合模式色谱中,控制流动相中总离子强度不变的情况下,随有机溶剂强度的增加,反相作用会减小,而单纯离子交换作用基本不变[20]。所以,直接将公式(3)取对数,不能得到logkT与φ的直线关系。只有当单纯离子交换作用贡献很小时,logkT与φ作图才有较好的线性关系。由于两个固定相的离子交换容量相当,可以近似根据图5的截距比较两个固定相的疏水性,从表4可知,Ph/BS的截距大于BS,说明键合苯基增加了固定相的疏水性,与之前的结果吻合。

图 5 碱性药物保留因子对数与流动相中乙腈体积分数作图Fig. 5 Plots of log kT vs. acetonitrile volume percentage in mobile phase for basic drugsa. BS phase; b. Ph/BS phase.

ColumnSolutelog kTSloper2BS salbutamol1.010.990.994 procainamide1.681.620.991 clonidine1.791.770.998 propranolol2.553.050.996Ph/BS salbutamol1.221.210.998 procainamide2.032.110.992 clonidine2.182.140.998 propranolol2.793.180.995

2.6 Ph/BS固定相色谱评价

选用5种碱性化合物对Ph/BS固定相进行色谱评价。从图6和表5可见,5种碱性药物得到很好的分离,并且峰形对称,对称因子(AS)都较小。除普鲁卡因胺外,其他碱性化合物的拖尾因子(Tf)都在0.95～1.05范围内。随保留时间延长,色谱峰相应变宽,但并不影响柱效和峰形。而且,柱效远高于药典对这5种药物提出的理论塔板数的要求(12 000～14 000 plates/m)。由于实验所用硅胶微球目标粒径为10 μm,其理论板高(h)在3～4之间,可以满足商品柱对柱效的要求。

目前许多商品的SCX固定相已经用于碱性化合物的分离[28-31],并得到较好的分离效果。双配体Ph/BS固定相与商品SCX固定相相比具有明显优势。首先,通过点击化学方法引入磺酸基团,延长了疏水侧链,增加了反相保留;其次,从上述机理讨论可知,在保证一定的离子交换容量的前提下,Ph/BS固定相也可以通过调节疏水性苯基的键合量来调控反相保留行为,对于疏水性不同的离子型化合物具有更强的选择性。

另外,硫醚嵌入基团对色谱保留性质也具有重要的影响[32-34]。首先,接近硅胶表面的极性嵌入基团对于硅羟基具有一定的屏蔽作用,从而减小碱性化合物与硅醇基作用引起的拖尾现象;其次,极性嵌入基团能够与流动相中的水分子形成氢键,增加固定相表面的极性,从而获得高水相兼容性的特点;最重要的是,硫-芳环之间会形成电子供体-受体体系,使得芳香化合物的保留和平面选择性明显增加。

图 6 Ph/BS固定相分离碱性药物色谱图Fig. 6 Chromatogram of the separation of the basic drugs on Ph/BS stationary phase

Solutetr/minN/(plate/m)hAsTfRsSalbutamol6.75265203.770.961.027-Procainamide13.08258933.860.811.2009.57Clonidine17.57314933.170.931.0384.73Propranolol23.79293003.410.990.9765.05Amitriptyline43.07325403.070.911.0109.87

tr: retention time;N: theoretical plate number;h: theoretical plate height;As: symmetrical factor;Tf: tailing factor;Rs: resolution; -: none.

3 结论

制备了两种RP/SCX混合模式固定相,5种碱性药物均获得了较好的分离,并且峰形对称。系统考察了流动相pH、离子强度和有机溶剂强度的影响,表明存在反相、单纯离子交换和反相协同离子交换3种作用,证明了三种作用形式的保留模型更适合混合模式固定相的机理研究。定量分析结果表明,在两种固定相上单纯离子交换和反相协同离子交换构成的总离子交换作用占主导,并且反相协同离子交换作用对溶质的保留和分离选择性影响很大,双配体固定相上增加疏水性苯基明显增加了协同效应。与文献[25]报道不同,单纯离子交换存在条件下,混合模式色谱中应用LSS公式,不能得到良好的线性关系。综上所述,依据三种作用形式的混合保留机理,不仅可以从流动相角度,通过改变流动相组成调节各作用的占比来优化色谱分离;还可以从固定相度角度,通过灵活改变各类型配体的比例来满足不同的分离要求。本研究对于新型色谱固定相设计及复杂样品的分离优化具有重要理论指导意义。