核心蛋白聚糖在结直肠癌组织中的表达及其与患者临床病理特征的关系

周 阳，侯玉龙，冯晨露，姬颖华，王 瑾，张 敏，路 平

(1.新乡医学院第一附属医院肿瘤科，河南 卫辉 453100；2.南阳市第一人民医院肿瘤科，河南 南阳 473000)

结直肠癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一[1]，也是全球癌症相关性死亡的主要原因之一[2]。在中国结直肠癌也是目前引起肿瘤相关性死亡的第5大病因[3]，根据流行病学趋势研究显示，CRC的病发率和致死率大体上呈逐年升高的趋势[4]。核心蛋白聚糖(decorin，DCN)作为一种核心糖蛋白，是重要的细胞外基质成分之一，可以抑制多种肿瘤如肝癌[5]、肾癌[6]和乳腺癌[7]细胞的体外增殖及迁移。本课题组前期研究证明，在常氧和低氧环境下，DCN均可以抑制人结直肠腺癌HCT116细胞的体外侵袭能力，且呈浓度依赖性[8]。DCN在人结直肠腺癌中的表达及其与临床病理特征的关系尚未见相关报道。本研究旨在探讨人结直肠癌组织中DCN表达及其与患者临床病理特征的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料收集2012年12月至2013年7月新乡医学院第一附属医院普外二科收治的结直肠癌患者手术切除标本34例及其对应癌旁正常组织标本34例，所有标本均经病理证实，且术前未给予任何放射治疗和化学治疗。其中男19例，女 15例，男女比例为 1.271；年龄26～75(50.23±11.01)岁，其中<60岁者22例，≥60岁者12例；根据美国癌症联合委员会肠癌TNM分期标准分为Ⅱ期13例，Ⅲ期11例，Ⅳ期10例；有淋巴结转移者18例，无淋巴结转移者16例；按肿瘤组织分化程度分为高分化19例，中分化10 例，低分化5例。本研究经患者及家属知情同意，并获新乡医学院第一附属医院伦理委员会批准。

1.2主要试剂与仪器小鼠抗人DCN单克隆购自美国SantaCRUZ公司(SC-73896稀释度比例为1100)，GTVisionIII抗鼠/兔通用型免疫组织化学检测试剂盒、二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB)显色试剂盒购自基因科技上海有限公司，枸橼酸钠缓冲液、磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)均购自北京索莱宝科技有限公司，Nikon ECLIPSE 55i型BX51荧光显微镜购自日本尼康株式会社。

1.3免疫组织化学法检测结直肠癌及相应癌旁组织中DCN的表达将结直肠癌组织及相应癌旁组织标本制作石蜡切片，厚度为3.0 μm，石蜡切片经二甲苯、梯度乙醇脱蜡至水，枸橼酸钠缓冲液微波炉修复；体积分数3%H2O2处理10 min，每次5 min，PBS洗3次，每次5 min；非免疫动物血清封闭10 min；甩去封闭血清，加稀释好的一抗，4 ℃过夜；PBS洗3次，每次5 min，加生物素标记的二抗，37 ℃孵育30 min；PBS洗3次，每次5 min，DAB显色，苏木精复染；切片经梯度乙醇、二甲苯脱水，中性树脂胶封片。以PBS代替一抗作为阴性对照。显微镜下观察免疫组织化学染色图片，每张切片挑选表达最密集处取3个视野，使用Image-pro-plus软件对DCN的相对表达量进行半定量分析。

2 结果

2.1结直肠癌和相应癌旁组织中DCN的表达DCN在癌旁组织中主要位于细胞外基质及纤维组织中，呈棕黄色粗大颗粒状，均匀分布(图1A)；DCN在结直肠癌组织中主要位于癌巢周围的纤维组织里，并将癌巢包裹，呈黄色颗粒(图1B)。DCN在结直肠癌组织及其相对应的癌旁组织中的相对表达量分别为0.066 9±0.040 6和0.210 5±0.013 7，DCN在结直肠癌组织中相对表达量显著低于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.05)。

A：癌旁组织；B：结直癌组织。

2.2结直肠癌组织中DCN表达与患者临床病理特征的关系男、女性患者结直肠癌组织中DCN相对表达量分别为0.074 4±0.048 1、0.062 8±0.037 3，男、女性患者结直肠癌组织中DCN相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。年龄<60岁和≥60岁患者结直肠癌组织中DCN相对表达量分别为0.072 6±0.041 0、0.057 8±0.038 7，年龄<60岁与≥60岁患者结直肠癌组织中DCN相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。有淋巴结转移和无淋巴结转移患者结直肠癌组织中DCN相对表达量分别为0.046 4±0.022 4、0.082 6±0.043 9，有淋巴结转移患者结直肠癌组织中DCN相对表达量显著低于无淋巴结转移者，差异有统计学意义(P<0.01)。临床分期Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期患者结直肠癌组织中DCN相对表达量分别为0.108 2±0.022 5、0.062 0±0.005 8、0.019 2±0.002 5，Ⅲ、Ⅳ期患者结直肠癌组织中DCN相对表达量显著低于Ⅱ期患者，Ⅳ期患者结直肠癌组织中DCN相对表达量显著低于Ⅲ期患者，差异均有统计学意义(P<0.05)。高、中、低分化结直肠癌组织中DCN相对表达量分别为0.075 9±0.038 0、0.060 5±0.038 4、0.018 3±0.001 8，低分化结直肠癌组织中DCN相对表达量显著低于高分化、中分化结直肠癌组(P<0.05)，高分化与中分化结直肠癌组织中DCN相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨论

肿瘤的发生不仅与遗传相关，也与细胞外基质以及构成肿瘤微环境的成分变化有密切关系[9-10]。肿瘤微环境是指肿瘤在其发生过程中所处的内环境，由间质细胞和细胞外基质组成。DCN是细胞外基质的重要组成部分，属于细胞外富含亮氨酸的小分子蛋白多糖家族[11]，具有4个不同的功能区域，通过细胞外基质中的其他分子相互作用，影响细胞间黏附及迁移，可能是肿瘤的发生、发展及转移的重要抑制因子[12-13]。外源DCN可通过激活表皮生长因子受体调节细胞周期蛋白p21通路，从而抑制细胞生长[14]。DCN可以和转化生长因子-β等多种生长因子结合，负性调节肿瘤细胞生长[15-16]。DCN也能通过调节巨噬细胞的功能和细胞因子的分泌来影响炎症反应[15-18]，并且多种肿瘤模型实验表明，DCN能够抑制肿瘤的生长、血管生成，阻止癌症转移[19-20]。本课题组前期研究结果显示，DCN可以抑制 HCT116细胞的体外增殖能力，并具有剂量依赖性，而且在低氧条件下DCN可能通过下调Hif-1α/CD133/TIMP-2来抑制HCT116细胞的体外侵袭[7]。

有研究显示，DCN在食管鳞状细胞癌的阳性表达与食管鳞状细胞癌的组织学分级、淋巴结转移、肿瘤分期和临床预后有关，DCN表达越高，食管癌患者预后越好[21]。另一项研究表明，间质中DCN的表达与乳腺癌患者的无病生存期呈正相关[22]。但目前关于DCN与结直肠癌患者的临床分期、分化程度及预后的相关性研究较少。本研究采用免疫组织化学方法检测结直肠癌组织中DCN的表达并分析其与患者临床病理特征的关系，结果发现，结直肠癌组织中DCN的相对表达量与患者的年龄、性别无关，而与有无淋巴结转移及临床分期有关，与分化程度可能相关；其中有淋巴结转移患者的结直肠癌组织中DCN相对表达量显著低于无淋巴结转移者；临床分期Ⅲ、Ⅳ期患者结直肠癌组织中DCN相对表达量显著低于Ⅱ期患者，Ⅳ期患者结直肠癌组织中DCN相对表达量显著低于Ⅲ期患者，即随着结直肠癌临床分期的增加，DCN相对表达量逐渐降低；在不同分化程度的结直肠癌组织中，低分化患者结直肠癌组织中DCN相对表达量显著低于高分化、中分化患者的结直肠癌组织，高分化与中分化患者结直肠癌组织中DCN相对表达量比较差异无统计学意义，与既往研究结果不一致[23]，可能是因为试验所用的病例数较少，低分化癌组织多集中在Ⅳ期，因此，DCN相对表达量较低，在后续研究中需扩大病例数，进一步探讨DCN与结直肠癌分化程度的关系。另外，本研究显示，结直肠癌癌旁组织中DCN相对表达量显著高于结直肠癌组织。以上结果提示，DCN的异常下调可能在结直肠癌的发生、发展中发挥作用。