基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法鉴定检疫性病菌炭疽菌

程颖慧，王 颖，杨晓朱，章桂明，冯建军，汪 莹

（1.深圳市仙湖植物园，广东 深圳 518000；2.深圳出入境检验检疫局，广东 深圳 518045；3.广东生态工程职业学院，广东 广州 510520）

咖啡浆果炭疽病（coffee berry disease）是由Colletotrichum kahawaeJ. M. Waller et Bridge引起的咖啡上的一种毁灭性病害，病原菌属于真菌界（Fungi）、无性型真菌（Anamorphic fungi）、炭疽菌属（Colletotrichum），寄主主要有阿拉伯种咖啡（Coffea arabica）、甘弗拉种咖啡（C. canephora）、利比里亚种咖啡（C.liberica）。咖啡浆果炭疽病菌主要分布在安哥拉、布隆迪、喀麦隆、中非、刚果（布）、刚果（金）、埃塞俄比亚、肯尼亚、马拉维、莫桑比克、卢旺达、坦桑尼亚、乌干达、赞比亚、津巴布韦、古巴等国家，严重影响这些国家咖啡种植业，造成的经济损失可达到60%，喀麦隆曾报道造成损失高达90%［1-2］。

炭疽菌属在分类鉴定上，比较形态学及致病性测定等鉴定方法潜在问题很多，不论是比较形态学还是分子生物学手段，都不能很好地解决炭疽菌的分类难题［3］。基质辅助激光解吸/电离（Matrix-assisted laser desorption/ionization，MALDI）技术在临床医学上应用较多，特别是细菌的分型鉴定中应用较为广泛且成熟，而在植物病原真菌分类、鉴定及检测中的应用则很少。在真菌鉴定方面，主要是用于鉴定酵母菌、酵母样菌和丝状真菌，如对曲霉、青霉、镰刀菌等的分型鉴定上的应有有一定的研究基础［4-18］。近年来，该方法也与分子生物学方法结合，用于各种病原体的检测和鉴定研究［19］。

本研究针对目前国内外基于形态学特征、血清学、分子生物学方法对炭疽菌进行检测鉴定的局限性这一难题，首次采用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱检测方法对炭疽菌进行分析，研究了影响MALDI TOFMS分析植物病原炭疽菌的重要实验因素，建立了MALDI TOFMS检测炭疽菌的标准实验方法，构建简便、快速、高通量检测技术平台，为保障我国农业生产和贸易提供必要的检疫技术手段，也为制定有关标准提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试菌株：供试炭疽菌菌株共13株，分别 为Colletotrichum kahawae（LC0082）、C. coffeanum（CBS396.67）、C. acutatum（MYA4519）、C. fructicola（LC 0032）、C. fructicola（LC 0033）、C. siamense（LC0034）、C.asianum（LC0037）、C. hymenocallidis（LC 0039）、C. karstii（LC 0042）、C. gloeosporioides（LC 0081）、C. horii（LC 0218）、C. fragariae（LC 0220）、C. simmondsii（LC 0937），25 ℃下液体培养基培养。其中LC编号的供试炭疽菌为模式菌株，由中科院微生物所蔡磊教授提供；MYA4519购自ATCC菌种保藏中心；CBS396.67购自CBS菌种保藏中心。

仪器：Bruker公司的MALDI microflex仪。

试剂：α-氰基-4-羟基肉桂酸（Alphacyano-4hydroxy-cinnamic acid，HCCA）， 芥 子酸（Sanipinic acid，SA），蜗牛消化酶（Snail digestive enzyme）；质谱校准标准品；无水乙醇、琼脂粉、葡萄糖，均为分析纯。

基质溶剂按乙腈∶三氟乙酸∶无菌去离子水（50%:2.5%:47.5%）的比例配置；称量5 mg HCCA或SA溶于500 μL基质溶剂中配置基质溶液，现配现用。

1.2 试验方法

1.2.1 样品处理 富集液体培养的菌丝，用无菌水充分洗两次，离心后，留菌丝弃上清。取适量洗净的菌丝体置于2 mL离心管中，再加入300～500 μL灭菌去离子水振荡混匀，最后加入3倍体积的无水乙醇振荡混匀，-20℃保存备用。取-20℃保存备用的菌丝5 mg，高速离心（10 000～16 000 r/min）2 min，弃上清，必要时，再离心一次，尽量去除乙醇和水。加入50 μL溶剂[70%甲酸∶100%乙腈(1:1) ]，在有冰袋控温的条件下超声波处理10 min后，高速离心（10 000～16 000 r/min）2 min，取 1 µL 上清液点样于MALDI TOF样品板上，室温下晾干，再点加1 µL基质溶液覆盖于样品层上，室温下晾干后上机检测。

1.2.2 分析条件 MALDI-TOF-MS参数：离子源1：20.08 KV；离子源2：18.60 KV；延迟提取时间：340 ns（正离子检测方式）；质量范围 m/z值：1 000～20 000 Da；激光能量：35%（Offset：15%，Range：30%）。采用大肠杆菌（E.coli） DH5 alpha standards，在 flexControl 中的calibration中对 m/z 4 364.33000、5 095.82000、6 254.39000、6 315.19000等进行校正。

1.2.3 重复性试验 以LC0082样品为材料，在同一个样品板上重复点样4 个，进行MALDI分析，每个样品点采集5张图谱，共20 张图谱，得到每张图谱与20张图谱合成的一张图进行比较，根据获得的20 张图谱的log(score)值衡量方法的重复性，如果log(score)值大于2，表明图谱的重复性好。以LC0082在不同时间重复培养3次的样品为材料，重复点样4 个，进行MALDI分析，每个样品点采集5 张图谱，然后进行批与批之间的比较（即批1/批2、批1/批3、批2/批3），分别将两批样品的40 张图谱合成一张图放入数据库，每批的20 张图谱与合成的这张图谱进行比较，从而获得每张图谱的log(score)值，并得到批间的log(score)值。如果批间log(score)值大于2，表明重复培养的样品重复性好。

2 结果与分析

2.1 咖啡浆果炭疽菌模式菌株检测

采用标准方法对咖啡浆果炭疽模式菌株LC0082进行MOLDI TOFMS检测，获得的特异性蛋白图谱峰有9 个，分别为1 097.594、1 777.133、2 551.820、2 988.099、3 381.554、3 708.773、5 492.821、6 007.389、7 144.144、8 012.514（m/z），强度均在可用范围（SNR＞2，信噪比Signal-to-noise ratio, SNR），结果见图1。

图1 咖啡浆果炭疽病菌模式种LC0082的结果图谱

2.2 重复性试验

Biotyper软件分析结果显示，咖啡浆果炭疽病菌的每张图谱与20张图谱合成一张图（图2，封二）。通过比较获得的log(score)值均大于2，说明试验重复性好。

对供试的咖啡浆果炭疽菌进行3次重复培养获得的MALDI TOFMS图谱（图3，封二）可知，3批结果的log(score)值均大于2，说明批间样品的重复性较好。

2.3 方法适用性试验

供试的炭疽菌属内12种13个菌株（Colletotrichum kahawae、C. acutatum、C.coffeanum、C. fructicola、C. fructicola、C. siamense、C. asianum、C. hymenocallidis、C. karstii、C. gloeosporioides、C.horii、C. fragariae、C. simmondsii）的蛋白图谱均互不相同，每个种都有各自的特有峰（图4，封二），如C. kahawae的特有峰为1 097、1 777、2 551、2 988、3 381、3 708、5 492、6 007、7 144、8 012，C. acutatum的 特 有 峰 为 4 095、4 154、4 222、4 226、4 310、5 800、6 538、9 844、12 368。

炭疽菌属中其余11个种12个菌株的图谱分别与咖啡浆果炭疽菌模式菌株LC0082所构建的标准图谱进行比较，log(score)值均在2以下，分别为0.639（CBS396.67）、0.506（MYA4519）、0.885（LC 0032）、0.774（LC 0033）、0.882（LC 0034）、1.196（LC 0037）、1.094（LC 0039）、0.495（LC 0042）、1.708（LC 0081）、1.091（LC 0218）、1.721（LC 0220）、1.005（LC 0937），表明该方法能实现炭疽菌属不同种的鉴定。从图4（封二）可以看出，LC0081与LC0220的比值比起其它菌株要高很多。

3 结论与讨论

本研究获得了炭疽菌12 个种13个菌株的标准图谱，创建了炭疽菌蛋白质谱指纹图谱标准数据库；首次建立了炭疽菌C.kahawae的MALDI TOFMS检测方法，该方法快速、准确、高通量、重复性好，能够对同一样品和3次重复培养样品获得准确、可靠、一致的结果。这种可靠的重现性是建立MALDI TOFMS指纹图谱数据库，经图谱库检索实现未知菌株鉴定的基础；运用本研究所搭建的MALDI TOFMS检测平台为其他真菌快速、微量、高通量及标准化检测开辟了新的途径，该技术在真菌学、植物检疫领域具有十分广阔的发展前景。

本研究建立了MALDI TOFMS分析炭疽菌的标准方法，该方法综合考虑了MALDI TOFMS分析的各种影响因素包括前处理、基质、基质溶剂、样品和基质的比例、点样方法等样品前处理是影响整个分析的关键，是首要影响因子，是产生准确性和可重复性数据的前提。样品前处理主要是去除杂质的影响和破除细胞壁的作用，以使更多的检测成分得以释放；而基质的选择主要从基质的结构和性质以及和样品之间的相互作用考虑，与待分析的样品和使用其他试剂关系较大；基质溶剂首先应具有对样品和基质的共溶解能力，且不与基质产生相互作用，并能提供合适的pH值，以利于样品分子的电离；点样方法主要影响结晶的均匀性及样品和基质之间形成的结晶结构，从而影响图谱的重现性、信号的质量和质量范围等。这些影响因素在 Amiri-Eliasi等［12］研究Saccharomyces cerevisiae、Welham等[20]分析Penicilliumspp.、Scytalidiumdimidiatum和Trichophytonrubrum、李凤琴等［4］分析不同属食品真菌、Riat等［14］分 析Aspergillusniger、Rhizopusoryzae、Trichodermaressei等的过程中均有提到。

本研究收集的炭疽菌中有11株是模式菌，模式种来源可靠，用来建立标准图谱继而建立标准图谱鉴定数据库，具有说服力和可靠性。

炭疽菌目前分类情况复杂，形态学鉴定需要经验丰富的专家才有可能正确完成，且历时长；而同工酶、血清学等方法也存在结果不稳定、特异性不强等问题；分子生物学方法也存在操作复杂、假阳性、假阴性、登录的公开序列有错误的情况，因此分子生物学的鉴定也存在一定的问题。越来越多的学者认为，对于复杂真菌的鉴定，需要综合多种手段全面考虑，以确保结果的准确性。MALDI TOFMS分析过程简单、快速，不需进行DNA提取、序列测定和分析、特异引物的设计、条件筛选及灵敏度实验等，只需要微量菌丝（2 mg）不需产生孢子就可实现鉴定，几分钟就可以完成一个样品分析，每个样品的自动图谱可以在几秒钟内完成，一个完整的数据又可以放进鉴定软件里进行分析。另外，MALDI TOFMS具有高通量的优点：一个样品靶同时一次性点样96个，一次性可以检测96个目标样品，几分钟内同时完成鉴定，大大缩短检测时间，提高检测效率，因此MALDI TOFMS技术在其研究上有广阔的前景。

采用MALDI TOFMS分析炭疽菌属内不同种，通过对模式菌株的重复试验得到蛋白质特异信号峰，成功找到区分的信号峰，实现炭疽菌不同种菌株的成功鉴定，建立了MALDI TOFMS分析炭疽菌的检测方法，该方法快速、准确、重复性好、高通量、对样品要求的纯度不高，能耐受一定量的小分子如盐、去污剂等，具有较高的检测范围。同时，该方法所需要的样品量少，即使样品的量和浓度很低，通过仪器和信号的累加功能同样可以获得一张高分辨率和高质量的质谱图，对于炭疽菌的鉴定检测是一种非常好的方法。

该方法在真菌检测方面也存在一定的局限性。例如，真菌常表现出完全不同的表型，蛋白图谱可能和生长条件有关，需要进一步深入分析；需要严格控制培养条件，有报道指出菌丝、孢子以及菌丝和孢子混合的蛋白图谱有可能不同；固体培养和液体培养方式对检测结果也有一定影响，有报道指出液体培养基摇出来的菌比固体培养的菌会得到更多的峰，重复性更好；培养基的种类也可能存在影响；蛋白的提取需要标准化才能进行推广应用，否则有可能得到完全不同的图谱而造成鉴定上的错误。目前真菌的数据库内容非常缺乏，特别是植物病原真菌的蛋白数据库，因此需要进行大量的基础研究充实真菌鉴定数据库。本研究充分考虑到以上局限性，在培养条件、蛋白提取等实验前处理步骤进行了严格控制，所有操作均在一致条件下进行，确保结果可靠性，试验结果也证明了本研究的重复性。

图2 咖啡浆果炭疽病菌同一样品4个样品点的20张图谱

图3 3批咖啡浆果炭疽病菌样品的重复性试验结果

图4 啡浆果炭疽菌、尖孢炭疽菌及炭疽菌其他种的MALDI TOF MS图谱