穿心莲无菌外植体快繁体系初探

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(贵州农业职业学院， 贵阳 551400)

穿心莲(Andrographispaniculate(Burm.f.)Ness)为爵床科穿心莲属一年生草本药用植物，植株高50～100 cm，地上茎为直立四凌形，又名一见喜、揽核莲、苦草等[1]。因其具有解热抗炎、增强免疫、抗病毒、抗肿瘤、抗心血管疾病等作用而被广泛应用于医药领域的研究[2]。 在传统的育种方法中穿心莲是以种子播种繁殖为主，由于穿心莲种子皮厚且硬，其发芽受到极大的影响，难以满足工厂化大量育苗的需求[3]。采用组培快繁技术在短期内培育出大量整齐一致的试管苗，加快穿心莲的繁殖速度，不仅确保具有优良性状的穿心莲得到保种，更有利于穿心莲在医学和药学等领域的应用。然而在实践生产中穿心莲的组织培养依然存在限制其大规模推广的问题，主要包括材料污染现象、褐化现象以及试管苗玻璃化等[4]，使其产量和品质在一定程度上受到较大影响。因此，建立一套较为成熟的穿心莲的离体快繁技术，对促进种苗的工厂化生产与应用具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材 料

本实验以穿心莲为材料，由贵州农业职业学院提供。MS培养基购置于上海博微生物科技有限公司，以MS为基础培养基，生长激素为6-BA和NAA。

1.2 方 法

取新鲜的穿心莲幼叶、腋芽、带腋芽茎段和不带腋芽茎段为外植体材料，先用自来水清洗材料表面的灰尘，再用洗涤剂对材料进行刷洗，放置于自流水冲洗2 h将材料表面洗涤剂除尽，将其分别装入无菌瓶中。随后在超净工作台上用70%乙醇浸泡10 s，无菌水冲洗干净，将外植体材料放置于盛有1% HgCl2的培养皿中，分别进行2，4，6，8 min的消毒，无菌水冲洗6次。最后，将处理好的外植体材料分别接种在不同处理的MS琼脂培养基中，设置温度为25 ℃，光强为2 000 lx的环境下进行培养，28 d后统计污染率。运用L16(43)正交表进行试验(见表1)，用Microsoft Excel 2007及SPSS 20.0软件进行数据处理与分析。

表1 正交试验L16(43)设计

水平因素A:外植体B:消毒时间(min)C:培养基配比(mg/L)1叶片2MS+1.0mg/L6-BA+1.0mg/LNAA2腋芽4MS+1.5mg/L6-BA+1.0mg/LNAA3茎段6MS+1.0mg/L6-BA+1.5mg/LNAA4带腋芽茎段8MS+1.5mg/L6-BA+1.5mg/LNAA

2 结果与分析

通过正交设计方法对穿心莲外植体进行无菌培养，研究发现在所有处理中最低污染率为3.33%，而最高污染率达66.67%(见表2)。

表2 正交设计L16(43)实验结果

处理外植体数(个)污染数(个)污染率(%)1 A1B1C1301860.002 A1B2C2301033.333 A1B3C330516.674 A1B4C430620.005 A2B1C2302066.676 A2B2C1301136.677 A2B3C430413.338 A2B4C330516.679 A3B1C3301550.0010 A3B2C430930.0011 A3B3C130516.6712 A3B4C230620.0013 A4B1C4301653.3314 A4B2C330826.6715 A4B3C23013.3316 A4B4C130310.00

注：其中穿心莲污染率计算公式为：污染率(%)=污染数/处理总数×100%。

2.1 各因素直观分析

极差(R)的大小是分析因素对试验结果影响程度的重要依据，极差越大说明该因素对实验结果影响越强，反之，极差越小该因素对实验结果影响越弱。由表3可知，参试三因素对穿心莲无菌外植体影响的主次关系是B>A>C，说明消毒时间对穿心莲无菌外植体的影响最大，其次是外植体种类，影响最小是培养基的类型。另外，平均值(Ki)的大小可作为挑选最优组合的依据。分析可知，获得穿心莲无菌外植体的最优水平组合为：A4B3C3。

表3 3个因素对穿心莲污染率的直观分析

水平因素A:外植体B:消毒时间(min)C:培养基配比(mg/L)K1j9.7517.259.25K2j10.009.509.25K3j8.753.758.25K4j7.005.008.75R3.0013.501.00

2.2 各因素方差分析

利用SPSS 20软件进行方差分析，从表4可知，4种外植体之间p=0.22>0.05，4种消毒时间p=0.63>0.05，4种培养基间p=0.49>0.05，表明3个因素对穿心莲污染率的影响都不显著。

综上分析可知，为了迅速高效地获得穿心莲无菌外植体，应选用A4(带腋芽茎段)为试材，消毒时间B3为6 min最佳，培养基C3为最佳。所以，A、B和C三因素的最佳水平组合为：A4B3C3，即最佳外植体为带腋芽茎段，HgCl2消毒最佳时间为6 min，愈伤组织诱导的最佳培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+1.5 mg/L NAA。

表4 3个因素对穿心莲污染率的直观分析

变异来源平方和自由度均方FpA:外植体22.2537.420.140.22B:消毒时间447.253149.082.840.63C:培养基配比2.7530.920.020.49误差472.25952.47

3 讨 论

在植物组织培养中，外植体接种是组培的前提条件[5]。然而外植体能否接种成功，外植体的选取、消毒时间以及培养基组成至关重要[6]。本试验通过研究不同外植体、HgCl2消毒处理时间以及不同培养基组成对穿心莲愈伤组织诱导及植株再生的影响，发现经0.1%的HgCl2消毒处理不同外植体时，最适宜的消毒时间不同。消毒时间对获得穿心莲无菌外植体的影响最大，其次是外植体种类，影响最小是培养基的类型。在穿心莲组培中，应当首选带腋芽茎段为外植体建立无性系，消毒时间为6 min，培养基MS+1.0 mg/L 6-BA+1.5 mg/L NAA为最佳培养基，最佳组合为A4B3C3。

本研究初步确立穿心莲无菌苗体系的关键因素，并建立无菌苗体系的最佳条件，并获得了穿心莲愈伤组织和侧芽的大量无菌外植体，为穿心莲无性系建立及基因转化奠定了基础。