北柴胡根尖染色体制片技术研究

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(1.西南科技大学 生命科学与工程学院， 四川 绵阳 621010；2.四川德培源中药科技开发有限公司， 四川 绵阳 621000)

细胞遗传学主要研究染色体结构，是遗传学的重要分支。核型分析研究包括染色体出现时间、染色体数目及大小、着丝粒位置等染色体信息研究[1]。因为染色体的结构、大小及倍性差异导致不同的表型性状，不同的植物群体具有特定的核型特征，甚至来源于不同环境的同一物种也表现出独特的核型特征[2]。因此染色体特征及其他核型结构研究也是区分植物遗传多样性的有效手段。此外，核型分析对物理图谱构建、目的基因遗传定位、系统亲缘关系等研究具有重要作用[3]。

北柴胡(BupleurumchineseDC.)为伞形科(Umbellifetae)柴胡属多年生草本植物，是《中华人民共和国药典》2015版规定的正品柴胡基源植物。柴胡作为传统的中药材，具有和解表里、疏肝升阳、镇痛、镇静、保肝、止咳等功效。因其需求量的不断增加，我国柴胡野生资源日渐减少，导致我国目前正面临着柴胡药用资源短缺的问题[4-6]。同时目前柴胡药材市场种质混乱、产量和质量参差不齐，开展系统柴胡基源鉴定，保障柴胡正品用药极为重要[7]。本研究拟采用新型植物染色体制片方法研究剪根时间、取样根长、笑气处理时间及酶解时间对染色体制片效果的影响，以期系统探索北柴胡根尖细胞核型分析的最佳条件，为柴胡染色体鉴定与分析提供参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

本研究供试材料采用北柴胡审定新品种川北柴1号(川审药2015004)。川北柴1号种子由四川德培源中药科技开发有限公司提供。

1.2 方 法

1.2.1 材料预处理与染色体制片

将供试柴胡种子置于25 ℃培养箱中萌发，待植株胚根长至0.5～1.5 cm时剪取并装入0.5 mL容量的EP管中以获得根尖分生组织。将带新鲜样品的EP管置于密闭空间进行笑气(N2O)处理，处理完成后取出胚根，乙酸浸泡5 min后析出。将样品注入75%乙醇后置于4 ℃条件保存备用。

注：A、B为笑气处理2 h。C、D、E为笑气处理3 h。E、G为笑气处理4 h。H、I为笑气处理5 h。 图1 笑气处理时间对柴胡根尖细胞分裂状态的影响

制片前取出固定后保存的北柴胡胚根，用灭菌双蒸水漂洗掉乙醇。取20μL体积的无菌柠檬酸三钠缓冲液(含4%的纤维素酶和2%的果胶酶)，分装于0.2 mL的EP管中。利用干燥滤纸吸干清洗后的北柴胡胚根表面水分，用刀片切取2 mm长的乳白色根尖分生区，将分生区组织浸没于酶解液中，并37 ℃水浴34～42 min。水浴结束后，利用双蒸水稀释漂洗酶液2次后吸干EP管内水分，并注入无水乙醇控干。

制片时，将脱水控干的根尖样品注入乙酸并捣碎后，吸取10μL含组织样品的乙酸溶液滴于载玻片上，经苯酚品红染色后压片。制片完成后使用电子显微镜(OLYMPUS BX 51)观察拍照。

1.2.2 剪根时间

剪根取样时间为08：00—18：00时，每1 h为1个时间段，每个时间段内，隔15 min剪根取样1次。

1.2.3 剪根时胚根长度

北柴胡胚根根尖取样长度分别为小于0.5 cm、0.5～1 cm、1～1.5 cm、大于1.5 cm，共4个分组。

1.2.4 笑气处理时间

笑气处理时间分别为2，3，4，5 h，共4个时间处理。

1.2.5 酶解时间

酶解时间分别设置为34，36，38，40，42 min。

1.2.6 制片效果鉴定

对不同条件的制片进行镜检与分析。

2 结果与分析

2.1 取样时间对分裂项效果的影响

在各取样时间段中，09：00—10：00时和16：00—17：00时2个时间段内超过10%的北柴胡根尖细胞都处于有丝分裂期，该时期根尖细胞分裂最为旺盛(表1)。而其他时期处于有丝分裂时期的细胞较少，且很难识别清晰的染色体形态。

表1 剪根时间对北柴胡分裂项数目的影响

剪根时间分裂项数目剪根时间分裂项数目08:00—09:00+13:00—14:00+09:00—10:00+++14:00—15:00+10:00—11:00++15:00—16:00++11:00—12:00+16:00—17:00+++12:00—13:00++17:00—18:00+

注：“+”数量代表有丝分裂程度。下同。

注： A为酶解34 min；B为酶解36 min；C为酶解38 min；D为酶解40 min。图2 酶解时间对北柴胡根尖细胞染色体制片的影响

2.2 剪根时胚根长度对分裂项数目的影响

胚根生长长度的取样实验中，主胚根长至0.5～1 cm时，北柴胡根尖处于有丝分裂期且染色体清晰可见的细胞最多，其他生长长度的取材观察结果皆次于该长度(表2)。

表2 北柴胡主胚根生长长度对根尖细胞分裂状态的影响

胚根长度(cm)分裂项数目胚根长度(cm)分裂项数目 <0.5++0.5～1+++1～1.5++>1.5+

2.3 笑气处理时间对分裂项效果的影响

笑气处理2 h时，细胞内形态较长、相互缠绕，不便于计数，该时期染色体聚集程度较高(表3，图1)。处理3 h时，染色体长度缩短，但染色体有重叠。笑气处理4 h时，根尖细胞染色体长度适中，染色体间鲜有重叠，便于计数观察；笑气处理5 h时，染色体长度进一步缩短。

2.4 酶解时间对根尖细胞分裂项效果的影响

对北柴胡根尖细胞纤维素酶和果胶酶处理，处理时间34 min时，根尖细胞内染色质呈无序丝状聚集，难以观察到清晰的染色体结构(图2)。酶解36 min时，少部分细胞染色体开始分散，并呈现独立的染色体结构。酶解38 min时，大部分根尖细胞内能观察到独立分散的染色体结构，仅有少部分细胞仍为无序丝状聚集。酶解40 min时，制片观察视野内，染色体分散程度好最易于染色体观察。

表3 N2O处理时间对北柴胡根尖细胞分裂状态的影响

笑气处理时间(h)分裂项效果染色体形态2 +长,丝状,卷曲,缠绕3++较长,部分缠绕4+++长度适中,棒状,分散较好5+极短棒状

表4 酶解时间对北柴胡根尖细胞染色体制片的影响

酶解时间 (min) 分裂项效果染色体分散情况34+染色质呈丝状聚集36++部分染色体未分散开,少部分仍聚集呈丝状38++大部分染色体已分散,可以观察到独立结构40+++染色体完全分散开,易于观察42+染色体极易被冲散

3 讨论与结论

染色体制片技术是细胞遗传学的基础环节，从取样到制片的每一个环节都可能影响制片效果。此外，染色体较小的植物物种根尖组织更难观察到清晰的染色体形态，甚至在有丝分裂中期都很难区分独立的染色体结构，因此制片技术的具体处理对染色体准备极其重要[3]。理论上，植株根尖取样后的任何时期都能观察到有丝分裂中期状态的细胞，但如处于有丝分裂中期状态的细胞太少，进一步的核型分析很难实现。本研究通过剪根时间、取样根长、笑气处理时间及酶解时间对北柴胡的染色体制片技术进行系统研究，结果发现，北柴胡胚根长至0.5～1 cm时，在09：00—10：00时和16：00—17：00时2个时段分裂最为旺盛，最适宜于剪根取样；在对根尖进行处理时，笑气处理3～4 h，酶解40 min的细胞分散程度最佳，且染色体长度适中。梁乾隆等利用常规压片技术进行了中国柴胡属13种5变种24个居群的染色体数目及核型研究[8]。其报道北柴胡染色体数为2 n=12，这与本研究结果相一致(图1)。常规染色体制片技术中，样品预处理需在冰浴条件下进行，其处理时间在24 h以上[9]。此外常规制片技术所需的8-羟基喹啉、秋水仙素及α-溴萘等有机试剂均具有毒害作用[10-12]。本研究使用笑气处理柴胡根尖组织，且处理时间仅需3～4 h，较常规制片技术更为安全高效，因此本研究对柴胡核型研究、后期细胞遗传学研究及柴胡道地性系统研究都具有重要意义。因不同物种染色体大小和形态差异巨大，将本染色体制片技术应用与其他物种时，仍需对各处理进行系统探索以获得清晰的核型结构。