新疆芜菁茎部内生菌的分离鉴定

王丽君 马国财 韩爱芝 李雅雯 轩正英

摘 要： 为分析新疆芜菁茎部内生菌资源并揭示其物种特征，笔者采用传统平板培养，通过扩增菌株的16S rDNA，并进行序列分析的方法分离筛选芜菁茎部内生菌。结果共分离得到7株内生细菌，分布在5个不同属，6株菌为稀有放线菌。该研究首次在新疆芜菁茎部获得内生菌资源，并发现其分布较为广泛。

关键词： 芜菁；内生菌；分离；鉴定

Abstract： The study analyzed the resources of endogenous bacteria from the stem of turnips in Xinjiang and identified the species by microspore culture and 16S rDNA sequence alignment. The results showed that 7 endophytic bacteria strains were isolated and the 7 endophytes distributed in 5 different genera， 6 of them were rare acinomycetes. In this study， endophytic bacteria were isolated from stem of haploid turnip in Xinjiang for the first time， suggesting that endophytic bacteria resources were abundant and there was a wide range of turnips from Xinjiang.

Key words： Turnip； Endophytic bacteria； Isolation； Identification

植物内生菌是一类可以定植于宿主植物中的微生物。它们的部分或全部生活史都能够在宿主体内生活，并且不会危害宿主植物的细胞和组织，能与宿主在协同进化过程中互利共生。现已分离到的植物内生细菌主要有伯克氏菌属（Burkholderia）、泛菌属（Pantoea）、芽孢杆菌属（Bacillus）等54属120多种[1]，主要用于研究内生菌的植物有果树，烟草和药用植物等[2-4]，其目的主要是用于抑制使宿主植物致病的一些病原菌[5]。

芜菁（Brassica rapa L.），又称蔓菁，维吾尔语又称其为恰玛古[6]，系十字花科（Cruciferae）芸薹属芸薹种的两年生草本植物。主产于新疆南部地区，因其全身均可食用且具有一定的药用功效，一直是维吾尔重要的传统药食同源性植物。因其适应性强，栽培容易且耐贮藏[7]，尤其在新疆干旱缺水的南部广泛种植[8]。芜菁现代药理研究表明[9-12]，芜菁主要的活性物质是硫代葡萄糖苷、类黄酮和多糖成分，具有增强免疫力、抗辐射和抗疲劳等功效。目前对芜菁的研究多集中于活性物质的研究和功能的开发[13-15]，而芜菁内生菌资源的研究方面还较少，赵燃等对新疆芜菁根部内生菌进行分离鉴定，结果共分离到48株内生细菌，分为7个OTUs[16]；梁寒峭等在新疆恰玛古块根组织中29株内生真菌，分属于8个属的11个种[17]，芜菁茎部内生菌资源至今未见报道。

笔者采用南疆地区芜菁种质资源进行小孢子培养后，得到单倍体植株，并以其茎部材料为研究对象，通过传统方法分离筛选其内生菌，对南疆地区药食同源性植物的内生菌资源进行系统研究，为芜菁种质资源研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

新疆芜菁小孢子培养获得的单倍体植株于2016年9月12日采集于塔里木大学南疆特色果树高效优质栽培与深加工技术国家地方联合工程实验室。DNA提取相关试剂由新疆生产建设兵团国家重点实验室培育基地提供，PCR扩增体系相关试剂购自明日百傲（北京）科技有限公司，16S rDNA扩增用引物由上海生工生物技术有限公司合成。SW-CJ-2F超净工作台购自上海博迅实业有限公司，BH-2光学显微镜购自奥林巴斯，fcycler96孔PCR反应仪购自Bio-Rad公司，GEL Doc2000凝胶成像分析仪购自Bio-Rad公司。成品培养基TSA-YE（含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂）购自青岛宾得生物技术有限公司，

1.2 方法

1.2.1 芜菁茎部内生菌分离纯化 取芜菁材料无病症的茎部区域，用自来水冲洗30 min，晾干。然后用70%乙醇浸泡30 s，无菌水冲洗3次，再用含有2.5%有效Cl-的次氯酸钠溶液浸泡3 min，最后用无菌水冲洗4次，无菌条件下晾干。取最后一次冲洗的无菌水120 μL，涂布接种于TSA-YE平板上，30 ℃倒置培养3 d，观察有无菌落形成，以此验证表面灭菌效果。用無菌镊子和剪刀在表面灭菌后的芜菁茎部材料内部取5 g样品置于无菌均质杯中，加入45 mL无菌水，10 000 r·min-1均质2 min。取均质后的样液1 mL，加入到盛有9 mL无菌水的试管中，依次做梯度稀释至10-5，5个稀释梯度各取0.1 mL涂布于TSA-YE平板，每个梯度涂布两个平板，待样液完全吸收后，于30 ℃培养箱中倒置培养5 d，观察菌落生长情况并记录。

根据TSA-YE 平板上的菌落生长情况，对生长良好的菌株进行菌落形态观察并记录，然后挑取分离培养平板上的单菌落转接到新配制的纯化培养基上进行纯化培养。待菌体生长到足够的量时加入无菌甘油，置于冰箱-80 ℃保存备用。

1.2.2 芜菁内生菌基因组DNA的提取及16S rDNA扩增 收集纯化后的菌体置于无菌离心管（1.5 mL）中，分别加入480 μL TE缓冲液（1×） 和20 μL溶菌酶（50 mg·mL-1），180 r·min-1摇床振荡过夜（37 ℃）。分别加入SDS（20%）50 μL和蛋白酶K（20 mg·mL-1）5 μL，55 ℃水浴1 h。再加入550 μL酚∶氯仿∶异戊醇=25∶24∶1，12 000 r·min-1，10 min，取上清液，重复3次。取上清，加入异丙醇300 μL和3 mol·L-1的乙酸钠70 μL，放4 ℃沉淀DNA 30 min。12 000 r·min-1离心10 min，弃上清。用70%乙醇300 μL清洗离心产物，12 000 r·min-1离心5 min，弃上清，重复操作2次，待乙醇完全挥发，加入无菌超纯水50 μL充分溶解DNA，1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量，将提取的DNA放入-20 ℃冰箱中保存备用。

扩增16S rDNA所用引物为细菌通用引物。反应体系为（25 μL），其中包括：20.4 μL ddH2O，10×buffer 2.5 μL，0.5 μL dNTPs ，引物27F（10 μmol·L-1）和1492R（10 μmol·L-1）各0.5 μL，Taq DNA聚合酶0.1 μL，0.5 μL模板DNA 。反应条件为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性1 min，56 ℃退火 1 min，72 ℃延伸2 min，30个循环；72 ℃总延伸8 min。反应结束后用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。将符合条件的PCR产物送测序公司进行序列测定。

1.2.3 芜菁内生菌16S rDNA系统发育分析 使用DNAstar中Seqman软件进行序列拼接，使用Mega 6.0软件构建系统进化树，通过构建系统发育树，明确微生物的分类地位。

2 结果与分析

2.1 芜菁茎部内生菌分离纯化

采用传统的微生物分离方法共分离得到内生菌7株（WN1-WN7，见图1），根据菌落形态特征可以分为5类。通过革兰氏染色后显微镜观察发现，7株内生菌中革兰氏阳性杆菌3株（WN2、WN3和WN6）；革兰氏阳性球菌3株（WN1、WN5和WN7）；革兰氏阴性球菌1株（WN4），见表1。

2.2 芜菁内生菌基因组DNA的提取及16S rDNA扩增

采用细菌基因组DNA提取的传统方法进行芜菁茎部内生菌的基因组DNA提取。以上述DNA为模板进行菌株16S rDNA的扩增，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，结果显示PCR扩增产物条带单一，且清晰，大小在1 500 bp左右（见图2）。

2.3 芜菁内生菌16S rDNA系统发育分析

芜菁茎部内生菌16S rDNA测序后进行序列比对，发现7株内生菌分布于Kocuria、Microbacterium、Sanguibacter、Pectobacterium和Rhodococcus 5个不同属，还有一个为疑似新物种（表2）。从进化树上可知7株菌聚类于5个不同的分支，其中WN1和WN7同源性最高，属于同一种，其次为WN5，与前者属于同属不同种。WN2、WN3、WN6和WN4都是单独聚类于一支，遗传距离较远，其中WN4和其他6株菌差异最大，说明本地区的芜菁茎部材料内生菌具有丰富的物种多样性（图3）。

3 讨 论

芜菁富含多种人体所需营养成分，其中多种营养物质均高于同为根菜类的萝卜、大头菜，具有极高的品质和营养价值[18]。同时根据《本草纲目》等书籍中记载：芜菁具有益中气、利五脏、解邪毒等功效。《中药大辞典》[19]记载：芜菁系芸薹属植物，其根皮中含有的芸薹素成分能够对人类寄生虫和某些病原菌产生抑制作用。本研究从其可食部分的茎部分离内生菌，旨在体表比较小的部位分析内生物种的资源，为健康植株的共生菌种的后期研发工作提供理论思路。

新疆地处边缘地区，干旱少雨，尤其是南疆，位于塔克拉玛干沙漠边缘，属于极其干燥的气候。该种环境下分离出的植物内生菌本身应具备较强的抗旱能力。前期学者[16]在新疆北部地区的恰玛古根部中分离到48株内生细菌，包含7个OTUs。本研究对南疆芜菁茎部内生菌进行分离鉴定，共得到7株内生菌，包含5个OTUs。两者研究具有较大差异，其原因有以下几种，首先是试验材料：前者的材料是采集自中国新疆乌鲁木齐市米东区古牧地镇团结村十一小队的恰玛古，属于杂交系品种；本研究使用的试验材料是新疆芜菁小孢子培养获得的单倍体植株，属于样本量较少的纯系植株，由此造成所分离的内生菌种类较少；其次是试验部位的选取：前者是选择的成熟果实部分，该部分体积比较大，且是在地下生长，其内生菌种类多部分应归因于果实所生长的环境即根际微生物菌群的种类。本研究是采用的样品茎部，该部位未接触土壤，其内生菌全部来自于植物本身所生，且材料面积较小，取材所需量相对较大，对所分离的内生菌在植株茎部的分布比较具有代表性，所以两者虽研究的同一种植物，但物种从数量到种类都表现为较大的不同；第三是试验所用培养基：前者使用的培养基是LB培养基，本研究使用的TSA-YE培养基。比较两种培养基成分发现，TSA-YE培养基的营养成分较LB培养基多添加了多价胨、磷酸氢二钾和葡萄糖三种物质。多价胨属于有机氮源，其中除了含有蛋白质、肽和游离的氨基酸外，还含有少量的维生素和生长因子，能够满足微生物生长和代谢的需要[20-22]。内生菌分离结果不同部分可归因于培养基成分不同，所提供的生长因子和碳氮源的比例有所不同，本试验所分离出的内生菌较适合该种培养基，后续研究可以多设计几种培养基以期分离筛选到更多数目和种类的内生菌资源。

本研究共分离得到7株内生菌，其中多数为放线菌，表明新疆芜菁小孢子培养获得的单倍体植株中内生放线菌分布较多。能够与宿主植株共生，表明两者之间相互依存的物质资源具有一定的共同之处。放线菌能够产生多种抗菌物质，具有较强的抗氧化能力且含有潜在的抗肿瘤功能[23]。本文中使用的试验材料是可食用且对延缓衰老和抗肿瘤具有一定效果的植物，其内生菌的次生代谢产物应该是具有较好的生防功能，结合这一特点，后期可以对其内生菌的活性成分进行分析，以期得到该种植物对人体健康更有效的成分，为人类健康提供有价值的参考资料。

从新疆芜菁小孢子培养获得的单倍体植株茎部材料中分离到1株内生菌，与Micro- bacterium fluvii YSL3-15（T）具有98.83%的同源性，初步斷定为Microbacterium属，该菌株可能含有一些新的抗性物质，能够使该种植物产生特殊的耐旱和耐盐碱等的功效，其成分和作用机理有待进一步研究。后续试验可以对芜菁根、茎、叶、花和果实等不同部位中的内生菌进行分离和全面分析鉴定，以期获得更多的菌种资源，为后期抗菌活性的研究提供广泛的物资基础。

综上所述，新疆不同地区的芜菁内生菌资源差别较大，且各自都具有较丰富的物种资源，特别是南疆地区的分离结果中显示的菌株数量不多，此现象归因于本研究所选的材料是芜菁茎部，该部位是可食部分且所占植株面积较小，不易分离出内生菌，但其所分离的菌株在种属分布范围较大，为后期活性成分和功能性状研究奠定了良好的理论基础。

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