Axin1基因多态性与隐睾易感性的相关性研究

唐铁龙，黄静，邹兵，谭春林，付剑，李鑫

(川北医学院附属医院泌尿外科·泌尿生殖疾病研究室，四川 南充 637000)

隐睾是新生男孩中最常见的先天性异常，影响3.5%的男性新生儿[1]。虽然常被认为是一种中度畸形，但其是不育和睾丸癌最主要的危险因素。研究表明隐睾是多因素导致的疾病[2]，大量的研究支持遗传因素在隐睾发病中的作用[3-4]。

体轴抑制因子(axis formation inhibitior,Axin)，最初是从小鼠的分析鉴定融合基因，在胚胎发育过程中起着关键的作用。Axin1是与多种蛋白反应的多结构域的脚手架蛋白并且通过B-联蛋白复合体在WNT信号通路中作为一个关键的负性调控因子。研究表明，WNT信号通路在隐睾的疾病发展中起做至关重要的作用[5-9]。此外，Axin1不仅参与调节Wnt信号通路，也参与调节TGF-β、SAPK /JNK和p53信号通路[10-11]。对老鼠的研究表明Axin1功能完全失活导致早期胚胎致死率在9.5 d，并伴有前脑截断，神经管缺陷，和胚胎轴重复。Axin1可能参与胚胎和出生后的发育与疾病[12-13]。因此，隐睾风险和Axin1基因可能有关联。

Axin1基因位于染色体16p13.3 的一个65 kb的区域内。为了研究Axin1是否与隐睾的发病相关，实验在中国汉族人中散发的113例隐睾患者和179名健康对照人群研究了Axin1的3个标签SNPs和隐睾发病的相关性。

1 材料和方法

1.1 研究对象

研究获得川北医学院附属医院伦理委员会批准，所有参与者的父母提供书面同意。实验组收集113例隐睾患者和179名不相关健康志愿者。实验组来自2008年9月到2012年6月入住川北医学院附属医院患者。患儿出生后常规体检并且在3个月龄重复体检，应用SCORERK定义隐睾及体检结果。所有的检查都是在温暖的环境下婴儿仰卧位的条件下进行的。将睾丸沿正常下降途径的熟练操作到最末端的位置记录睾丸的位置，但不使用暴力扭转。患儿1岁左右行睾丸固定术之前再次确认诊断。单侧隐睾92例，双侧隐睾21例；其中腹股沟浅袋32例，阴囊前间隙28例，外环27例，腹股沟管内17例，内环9例。对照组来源于包皮环切术患儿，年龄1个月～10岁，平均年龄(3.8±1.2)岁。早产或低出生体重的任何个人史或家族史的隐睾症或其他严重疾病被排除在外(包括患儿和对照组)。所有的病例都来自居住在中国西南的四川汉族人。

1.2 SNP的筛选及基因分型

标签SNP在基因组某个区域中具有高度连锁不平衡(2个或多个位点的等位基因的非随机关联性)的代表性SNP。根据标签SNP基因分型在HapMap计划的CHB人口抽样数据选择标签SNPs。Axin1基因的标签SNPs位于内含子区域的rs370681，rs12921862和位于同义密码区域的rs1805105，是从国际性HAMMAP项目(http://WWW.hapmap.org/index,html.zh)用tagger parwi-seTagging算法为中国北京的汉族人中挑选出来的。每个个体基因组DNA是通过DNA提取试剂盒提取bioteke(北京，中国)从200 mL EDTA抗凝外周血样本的。并按照说明书的步骤进行操作程序。

引物顺序和DNA序列分析的限制性内切酶见表1。随机抽取10%的样本进行重复检测，结果与之前的结果100%一致。

1.3 统计学分析

所有的数据分析都是运用的SPSS 17.0软件。3个SNP的基因型频率是通过直接计算所得到，HARDY-WEINBERG平衡是通过方差检验评估得到呈现共显性，显性，隐性，超显性或者Log-additive遗传模型病例-对照模型基因型关联测验是用SNPstates完成。

OR值和95%CI评价等位基因与基因型间的差异性。P<0.05被认为在隐睾患者和健康对照组之间有统计学意义。

表1 引物序列和酶

2 结果

3个标签SNP在113例隐睾症患者和179名对照者中都被成功地基因分型。3个多态性的基因型分布符合hardye-weinberg平衡。Axin1基因标签SNPs等位基因频率见表2。隐睾患者rs370681位点中T等位基因频率明显高于对照组(P=2e-4，OR1.96，95%CI 1.37～2.78)但rs1805105和rs12921862多态性的等位基因频率在隐睾患者和对照组之间没有差异(P=0.119，OR0.732，95%CI 0.502～1.067；P=0.245，OR1.572，95%CI 0.785～3.148)。

如表3所显示，患者和对照组的rs370681多态性分布明显不同。与C/C基因型相比，C/T基因型携带者隐睾症的风险增加2.17倍(P= 6e-04，95%CI1.28～3.70)。而且在共显性组中T/T基因型隐睾风险增高4倍(P=6e-04，95%CI 1.79～9.09)与C/C基因型相比，在显性组中C/T-T/T基因型隐睾风险增高2.44倍(P=4e-04，95%CI 1.47～4.00)。同时，与C/C-C/T相比较，T/T基因型隐睾风险增高2.56倍(P=0.012，95%CI 1.22～5.26)。

此外，观察到rs1805105多态性的基因型差异显著。与T/T相比较，C/C-C/T基因型隐睾风险增高1.64倍(P=0.041，95%CI 1.02～2.63)，此外，与T/T-C/C基因型相比，C/T基因型携带者隐睾症风险增加1.72倍(P=0.032，95%CI 1.05～2.86)。在rs12921862多态性与隐睾症风险的遗传模型中没有观察到显著的关联。

表2 Axin1标签SNPs等位基因频率与隐睾患病相关性[n(%)]

表3 实验组和对照组Axin1标签SNPs基因型频率与隐睾患病相关性[n(%)]

3 讨论

隐睾，也称睾丸下降不全，是新生男孩的一种最常见的先天性异常[14]，并且被认为是睾丸癌形成的危险因素。Pathak等[15]综合21篇病例对照研究的流行病学的Meta分析中提出，对于曾经罹患过隐睾的患者，患有睾丸癌的OR值从3.5～17.1，总的相对危险度为4.8(4.0～5.7)。虽然有几种发病机制用于解释隐睾，但在大多数病例，隐睾症的原因尚不清楚[16]。一些学者发现疾病有家族聚集性，隐睾症家族史是隐睾症的危险因素。初步研究发现6.2%隐睾患者的兄弟和1.5%～4.0%的隐睾患者的父亲患有隐睾症[17-19]。综上所述，遗传因素可能对隐睾症的发展起一个至关重要的作用。

Wnt信号通路调节脊椎动物和无脊椎动物的细胞的增殖、分化、形态和运动[8]，多项研究已经证实Wnt信号通路在小鼠胚胎和出生后的发育和疾病的重要性[5,12,20-22]，并有研究发现Wnt信号通路的激活可能与隐睾发病相关[9]。Axin1是野生型Axin基因，该通路的负调节因子，被认为在胚胎发育过程中发挥重要作用。广泛表达的Axin1参与了胚胎神经轴的形成[23-26]。总之，Axin1可能在隐睾的发展中扮演做一种重要的角色。在选择的Axin1 3个标签SNPs中，两个SNPs位于内含子区，另1个SNP位于同义密码子区域。证据研究表明内含子和其他非蛋白编码RNA在高等生物中可能作为网络控制分子，使得这些生物从一个简单的单输出蛋白遗传操作系统的限制中释放出来[27]。因此，标签单核苷酸多态性可能会作为控制区去影响其他基因的传导影响其他基因的行为，而不是通过影响氨基酸的翻译去影响蛋白质的结构.

实验研究了Axin1基因的遗传变异对隐睾的影响，并且观察到隐睾患者和对照组的Axin1基因SNPs的等位基因和基因型频率变化具有显著差异，为Axin1基因的rs370681基因多态的T/T基因型和rs1805105基因多态的C/T基因型在隐睾患者中的频率更高提供了重要的证据。结果提示这些等位基因和基因型可能是隐睾发展的危险因素。