台湾蠛蠓r DNA-ITS序列测定与分析

陈 敏,肖 颖,林妙端,黄恩炯

台湾蠛蠓(Lasiohelea taiwana)又名台湾铗蠓(Forcipomyia taiwana)、南方蠛蠓,是闽台等地重要的吸血蠓.该蠓在南方诸省均有分布,1957年首次从福建乙脑流行区捕获的台湾蠛蠓中分离出乙型脑炎病毒[1],而后中山医学院又从广州采获的台湾蠛蠓中又分离出乙型脑炎病毒[2].闽、粤两地的调查均认为该蠓的数量消长曲线与乙型脑炎病毒的流行季节吻合,以及本种蠛蠓嗜吸人血,又刺叮乙脑病毒的宿主动物－猪等原因,因而认为该蠛蠓可能是当地乙型脑炎的媒介昆虫之一,但至今未得到证实.

目前,台湾蠛蠓的鉴定主要依靠传统的形态学鉴定,需要进行玻片标本制作,步骤多、周期长、耗时费力,因此,亟需寻求一种准确而新的分类方法.r DNA广泛分布于各种生物细胞中,在功能上具有高度的保守性和良好的时钟性,其测定序列常用于物种分类和生物间系统发育的研究,尤其是物种的种间分类研究[3-5].目前r DNA作为遗传标记在寄生虫鉴定中的应用日趋广泛,前人对此作了详尽的描述[6-8].ITS是位于r DNA上18S和28S基因之间的区域片段,包括ITS1和ITS2两段序列,由于该区域不加入成熟核糖体,所以受到的选择压力较小,进化速度较其他区域快,具有种内变异小而种间变异大的特性,加上协同进化作用保证了该片段在基因组不同单元间的一致性,因而适合进行各种分子操作,是较理想的种间鉴定和系统发育分析的遗传标志[9-12].近几年来国内外对ITS序列标记在蠓科昆虫中的研究和应用越来越多,r DNA的ITS1和ITS2序列在蠓类昆虫的鉴定中发挥了重要的作用[13-22].本研究以台湾蠛蠓为对象,通过PCR扩增其ITS基因,并对ITS基因序列进行分析,以期为建立吸血蠓的分子鉴定技术奠定基础.

1 材料与方法

1.1 试验对象 台湾蠛蠓采自福州周边地区,试虫均为雌虫,标本均用95%乙醇浸泡保存.取出保存的标本,将头、生殖器部分和翅切下,用于常规形态鉴定,剩余部分移入Eppendorf管中－20℃保存.每份标本组织单管保存并编号,编号与用于形态学鉴定的标本编号一致,确保标本组织的唯一性.形态学鉴定为台湾蠛蠓的标本组织用于后续DNA提取.同个地点采集的标本每次20～30只.

1.2 基因组DNA提取 参照昆虫基因组DNA提取试剂盒说明书提取台湾蠛蠓DNA,略有改动.

1.3 ITS基因PCR扩增

1.3.1 ITS1基因 扩增引物参考文献[15]:Pan CulF 5′-GTAGGTGAACCTGCGGAAGG-3′,Pan CulR 5′-TGCGGTCTTCATCGAACCCAT-3′[15].反应体系和反应条件见表1和表2.

表1 ITS1基因PCR反应体系Tab.1 PCR reaction system of ITS1 genes

表2 ITS1基因PCR反应条件Tab.2 PCR reaction conditions of ITS1 genes

1.3.2 ITS2基因 扩增引物参考文献[20]:5.8S 5′-GATGAAGACCGCAGCAAACT-3′,28S 5′-ATTTGGGGGTAGTCACACAT-3′.PCR 反应体系同ITS1,PCR反应条件见表3.

表3 ITS1基因PCR反应条件Tab.3 PCR reaction conditions of ITS1 genes

1.4 电泳检测 取5μL PCR产物,在浓度为1.2%琼脂糖凝胶中进行电泳,电泳缓冲液为0.5×TBE.电泳结束后于凝胶成像仪中观察、拍照并记录结果.

1.5 序列测定与分析 PCR产物的纯化与测序委托上海生工生物工程公司完成.用DNAMAN、BioEdit、clustal X、MEGA等软件进行序列分析并构建系统进化树.

2 结 果

2.1 r DNA-ITS基因的扩增 台湾蠛蠓r DNAITS1、ITS2基因PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后,与DL-1000 Marker进行比较,发现ITS1和ITS2分别在约310 bp、约360 bp左右处有一条特异性的明亮条带(图1).

2.2 台湾蠛蠓ITS1、ITS2序列分析 将所测得的序列,通过NCBI BLAST在线分析系统与GenBank收录的全部序列进行比较,结果表明:台湾蠛蠓ITS1株间同源性96%～98%,与汤斯维尔铗蠓Forcipomyia townsvillensis的同源性最大,有172个碱基相同,同源性为71%;其ITS2片段株间同源性99%～100%,同样是与汤斯维尔铗蠓的同源性最大,有144个相同碱基,同源性为92%.

图1 台湾蠛蠓r DNA-ITS基因扩增结果Fig.1 PCR amplification of rDNA-ITS gene of Lasiohelea taiwana

比较ITS1序列时,除了本试验所测台湾蠛蠓序列外,还选用了GenBank所查得的几种蠓相应的ITS1序列.8种蠓的ITS1序列长度范围为271～469 bp,G＋C含量为26.79%～34.53%.台湾蠛蠓的ITS1序列长度与两铗蠓的序列长度相当,均在270～300 bp之间,而库蠓的ITS1序列长度在不同的蠓种间相差很大.台湾蠛蠓的ITS1序列长度与G＋C含量均介于库蠓与铗蠓之间(表4).

表4 8种蠓ITS1基因序列组成Tab.4 The sequences composition of ITS1 genes from 8 biting midges

比较ITS2序列时,将台湾蠛蠓ITS2序列与GenBank所查得的3种库蠓、2种铗蠓以及双翅目中的白纹伊蚊(Aedes albopictus)、有羽摇蚊(Chironomus plumosus)的已知序列进行比较.8种双翅目昆虫的ITS2序列长度范围为205～435 bp,G＋C含量为20.87%～56.35%.台湾蠛蠓的ITS2序列长度与两铗蠓的序列长度相当,均在300 bp左右.库蠓的ITS2序列长度较短,范围在200～250 bp,而白纹伊蚊、有羽摇蚊的ITS2序列长度明显大于蠓类,分别为424 bp与435 bp(表5).

表5 8种双翅目昆虫ITS2的登录号及序列组成Tab.5 The sequences composition of ITS2 genes from 8 dipterons

2.3 台湾蠛蠓ITS1、ITS2的系统发育分析 采用最大似然法(Maximum Likelihood)构建台湾蠛蠓的ITS1、ITS2序列系统进化树(图2,图3).结果显示,基于ITS1、ITS2基因分类结果与形态学传统分类结果一致,在系统进化树上聚类成库蠓属、蠛蠓属和铗蠓属3个分支.在系统进化树上各蠓种均先与同属蠓种聚类,再与不同属其他蠓种聚类.

图2 台湾蠛蠓r DNA-ITS1基因核苷酸序列系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree of rDNA-ITS1 gene sequences of Lasiohelea taiwana

图3 台湾蠛蠓r DNA-ITS2基因核苷酸序列系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree of rDNA-ITS2 gene sequences of Lasiohelea taiwana

3 讨 论

目前,对台湾蠛蠓的识别还是采用传统的形态学鉴定方法,但是在病媒生物监测中,很有可能得到的是不完整的标本.在这种情况下,依靠传统的形态学鉴定的办法难以迅速得到结果,而分子鉴定技术能很好地解决这一难题.

r DNA是生物体内最保守的基因之一,其内转录间隔区ITS具有极大的种间甚至种内变异性,被认为是发展敏感、特异检测系统的理想靶物.Mathieu等[16]利用r DNA-ITS1作为靶标基因建立了不显库蠓复合体(obsoletus complex)分子鉴定方法;Perrin等[15]对残肢库蠓(C.imicola)进行ITS1序列测定和系统发育分析,种内同源性高达99.8%;对蠓ITS2的研究也都表明,ITS2作为靶标基因不仅有利于鉴定蠓新种,还能有效辅助澄清库蠓亚属里的同种异名[20-21],分子鉴定与形态学鉴定相佐证能够解决蠓形态学鉴定中的难题.

本研究中,从ITS1和ITS2的片段长度上看,台湾蠛蠓的片段长度均较接近铗蠓,与库蠓及其他双翅目昆虫如白纹伊蚊、有羽摇蚊的ITS1和ITS2长度区分明显.蠛蠓属原是铗蠓属内的一个亚属,虞以新[23]根据其特有的形态将其独立为一个属.本研究所得台湾蠛蠓的ITS1、ITS2进行系统发育树显示台湾蠛蠓和铗蠓属先聚类于同一分支,从分子生物学方面验证了形态分类学结果.

而库蠓ITS序列长度在不同的蠓种间相差很大,在ITS2系统发育树上,变翅库蠓(C.variipennis)与其他库蠓不聚类于同一分支,这与国外学者利用COⅡ基因研究蠓科分子分类时,发现C.saundersi不与其他库蠓聚类于同一分支的现象一致[24],可能是由于库蠓种类众多,种间基因变异大的原因所致.这也验证了真核生物ITS序列具有高度变异性的特点,在物种进化和遗传关系研究中具有重要的价值.

总之,r DNA-ITS可有效应用于蠓类的分子鉴定,而且能够提供足够的遗传信息,但在进行分类和种属鉴定时,不能仅考虑片段的长度,应结合序列组成和同源性进行综合评价.