稀土元素对短叶对齿藓生理生化的研究

高叶青 任冬梅

(内蒙古大学生命科学学牧草和特色作物生物技术教育部重点实验室，呼和浩特 010070)

稀土元素(REE)是17个化学元素的统称，包括镧系La-Lu，以及Sc和Y。它们作为一种氧化物存在，从稀有的矿产中发掘出来[1]。在中国，越来越多的稀土元素(REE)被长期用于工业和农业中，导致其在环境中的含量增加了，并在未来随着更广泛的应用含量可能进一步增加。位于中国内蒙古自治区包头境内的白云鄂博矿区是我国最重要的稀土生产基地，也是世界罕见的稀土矿山。包头白云鄂博矿区进行铁矿、稀土矿开采已近60年，稀土矿中伴生的232Th未利用而暴露于环境中，可能引起一定的环境风险[2]。因此，我们将稀土元素描述为新兴污染物，呼吁人们进一步研究加深了解它们的化学特性、生物利用度和它们与各种植物—土壤系统的地球化学相互作用[3]。不同苔藓物种中的REE分布形式和化学行为已经有一些研究报道：如Berg T,1991年对Hylocomiumsplendens和Pleuroziumschreberi进行的研究[4]，2001年Chiarenzelli研究的6种苔藓[5]，以及Dolegowska S对波兰中南部Leptodonsmithii的研究[6]等。到目前为止，人们对稀土的生物毒理作用的研究相当有限，有研究表明其浓度升高时会产生负面生理作用[7]，但具体机制并不清楚。

苔藓植物吸附能力强，对生长环境的要求不高，能够对外界环境中有色金属污染作出极为敏感的表现[8]。REE对植物表现出一些生物学效应，依剂量或者其他条件的不同对植物产生积极或消极的生理作用：适量的REE可以促进植物种子的萌发和根部的发育，并增加植物的生物量；植物体对REE的吸收有一定的临界浓度，适宜的浓度可以改善植物的生长发育，超过这个最佳值后可能导致植物的死亡[9]。La(NO3)3在1～3 μmol·L-1能促进根的生长，增强过氧化物酶活性和硝酸还原酶活性[10]。La3+在10 μmol·L-1时，促进Huperziaserrata的根系活力，是对照的1.7倍，在50～100 μmol·L-1时，则有负面效果[11]。Ce4+促进盾叶薯蓣(Dioscoreazingiberensis)的快速繁殖，5 mg·L-1的浓度是促进幼苗根组织形成的最好浓度，超过15 mg·L-1后会抑制根部的生长[12]。研究发现适当的稀土元素浓度可以提高叶片的叶绿素含量和促进植物生长，如银杏(Ginkgobiloba)，当稀土元素浓度为100 mg·L-1时，叶产量比对照组增加了11.64%，浓度达400 mg·L-1时，叶产量则降低19.3%[13]。白云鄂博的苔藓植物生长可能受到白云当地的土壤成分、稀土元素含量等因素的影响，由于之前我们对白云鄂博矿区的苔藓植物进行了形态解剖学特征的观察和研究，发现不同矿区由于基质土壤中的稀土含量有显著差异(主矿、东矿>西矿)从而导致苔藓植物的生长状况受到了显著的影响(3种藓类的叶长和叶宽均呈现西矿>主矿、东矿的规律)[14]，这促使我们想进一步了解这一影响的生理机制。本研究通过对组织培养后的短叶对齿藓(Didymodontectorum)进行梯度、定量地施加稀土元素的室内胁迫实验，测定其过氧化物酶活性、丙二醛含量和叶绿素含量，进而通过这3个主要生理指标的变化来初步了解稀土元素对苔藓植物生长的影响及其内在机理。有关利用组培后苔藓进行稀土元素胁迫的生理响应研究甚少，国内未见相关报道。本研究在利用苔藓植物进行环境修复以及用于稀土元素指示方面将具有重要意义。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料为组织培养生长出的短叶对齿藓，选取生长周期一致的短叶对齿藓分别接种到添加有Y3+(NO3)3,La3+(NO3)3,Ce4+(NO3)4的培养基中培养。3种试剂均为白色结晶固体，由山东西亚化学有限公司生产，分别配制成溶液待用。

1.2 方法

Y3+,La3+,Ce4+3种稀土盐溶液，每种盐溶液设置6个浓度梯度如表1，每个水平接12皿，将配置好的3种稀土盐溶液直接加在MS培养基中，将生长周期一致的短叶对齿藓组培苗分别转接到上述培养基中，培养30天后(培养温度21±2℃，光照强度3 000 lx，光照周期是光培养16 h暗培养8 h)，测定上述3种主要的生理指标。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 POD酶活性测定

逆境胁迫下，植物体内会产生大量活性氧(ROS)对植物体造成伤害，而抗氧化酶可清除这些活性氧，能提高植物对逆境胁迫的抵抗能力。为了研究稀土胁迫对短叶对齿藓抗氧化系统的影响，本研究选取了POD酶活性进行测定。称取各个不同浓度稀土元素处理30天后的短叶对齿藓组培苗0.1 g放入研钵中，加入0.9 mL 0.1 mol·L-1磷酸(pH7.0)缓冲液，冰水浴研磨成匀浆，在3 500 r·min-1下离心10 min，所得样本上清液进行测定。利用试剂盒(南京建成生物工程研究所)测定POD活性(表2)。

表1各处理浓度梯度设置表

Table1Concentrationgradientsettingtableforeachtreatment

浓度梯度Concentration gradient质量浓度Mass content(mg·L-1)摩尔浓度Molar concentration(mmol·L-1)Ce4+La3+Y3+0000012.51.78×10-21.8×10-22.8×10-2253.55×10-23.6×10-25.6×10-23107.1×10-27.2×10-21.12×10-14201.42×10-11.44×10-12.24×10-15503.55×10-13.6×10-15.6×10-1

表2 POD试剂添加步骤

混匀后，3 500 r·min-1下离心10 min，取上清液于波长420 nm处测吸光值。

计算公式如下：

POD活力(U·mg-1·prot-1)=△OD×10×30-1

(1)

1.3.2 MDA含量测定

鉴于土塞效应情况复杂，目前的受力分析主要基于简化为各向同性假定、采用一维竖向平衡的研究方法。如图1所示，将土塞视作由一系列厚度为的水平薄片组成，针对水平薄片建立竖向平衡方程为：

当植物遭受外界胁迫时，细胞膜首先能感知外部环境的变化，发生氧化。细胞膜系统对外界环境改变的敏感性，使其成为研究植物适应逆境能力的依据，尤其是质膜和类囊体膜。而丙二醛(MDA)和膜透性是衡量膜系统受伤害程度的最重要标志，其含量多少表明细胞膜过氧化程度的大小。MDA中样品组织液跟POD的方法一样，所用试剂均为南京建成(表3)。

表3 MDA试剂添加步骤

旋涡混匀器混匀，试管口用保鲜膜扎紧，用针头刺一小孔，95℃水浴40 min，取出后流水冷却，然后3 500～4 000 r·min-1，离心10 min，取上清液532 nm处，1 cm光径，双蒸水调零，测各管吸光度值。

1.3.3 叶绿素含量测定

叶绿素含量的高低与植物光合作用和营养状况密切相关，是反映稀土胁迫后植物生长状况的重要指标。取不同浓度稀土元素处理后的短叶对齿藓组培苗，称取0.1 g放入研钵中，加入1 mL蒸馏水，50 mg试剂一(南京建成生物工程研究所)，避光条件下充分研磨后置于10 mL玻璃试管内。用无水乙醇和丙酮混合液冲洗研钵，定容至10 mL，避光条件下浸提约3h,直到观察到底部残渣变白。分别测定663和645 nm处吸光度值。

1.4 数据处理

应用Microsoft Excel 2010和SPSS 21.0进行数据处理与统计分析，采用方差分析和Duncan新复极差法比较分析3种不同稀土元素在6个梯度浓度处理下对短叶对齿藓生理的影响。

2 结果分析

2.1 稀土元素对短叶对齿藓POD活力的影响

由图1可见，随着稀土元素浓度的增加，POD活力呈现先降低后升高之后持续下降的变化趋势，La3+、Y3+、Ce4+3种元素的变化趋势呈现一致性。通过单因素方差分析得出：对照组和稀土元素处理后的POD活力存在显著差异。各浓度处理均低于对照。各浓度处理相比短叶对齿藓的POD活力最高值出现在梯度2(Ce4+3.55×10-2mmol·L-1，La3+3.6×10-2mmol·L-1，Y3+5.6×10-2mmol·L-1)，这表明梯度2时，Ce4+和Y3+能提高短叶对齿藓幼苗POD活力，而La3+元素整体变化幅度较小，受到的胁迫影响最低。仅在梯度2时POD活力降到最低，La3+、Y3+、Ce4+溶液在高浓度处理下短叶对齿藓POD活力分别比对照显著降低84%、83%、85%。稀土元素浓度≤梯度2时，POD活力基本上呈现为Ce4+>Y3+>La3+；稀土元素浓度>梯度2时，POD活力基本上呈现为La3+>Y3+>Ce4+。3种稀土元素间差异较小，La3+元素不同浓度处理下的POD活力变化幅度不大，相对平缓，Ce4+元素变化最大，La3+和Ce4+仅在梯度4时(Ce4+1.42×10-1mmol·L-1，La3+1.44×10-1mmol·L-1)存在显著差异。差异性大小排序为Ce4+>Y3+>La3+，说明短叶对齿藓对于Ce4+元素胁迫响应较强烈，而对同浓度La3+元素胁迫响应较弱，变化幅度小。

图1 不同稀土元素不同浓度处理下短叶对齿藓的POD活力(平均值±标准误) 不同大写字母代表同一浓度下不同稀土元素间的显著差异性；不同小写字母代表同一稀土元素不同浓度间的显著差异性(P<0.05)；下同。Fig.1 Effects of different rare earth elements treatments on POD(mean±SE) Different letters indicate a significance difference between difference rare earth elements with in the same concentrations,different capital letters indicate a significance difference between difference concentrations with in the same rare earth elements(P<0.05),the same as below.

2.2 稀土元素对短叶对齿藓MDA含量影响

经过La3+、Y3+、Ce4+处理的短叶对齿藓MDA含量随着稀土元素浓度的增加同样地表现出处理组均低于对照组，各浓度处理呈现先逐渐下降然后升高之后又下降的趋势。这与POD活力的变化趋势相一致(图2)。但各浓度处理相比短叶对齿藓MDA含量变化由降低到升高出现在7.2×10-2mmol·L-1时，较POD活力变化的值晚一些。而且在Ce4+7.2×10-2mmol·L-1时，短叶对齿藓幼苗的膜脂过氧化程度显著提高，La3+和Y3+也有相同的变化趋势，但不同浓度间差异不显著。Y3+元素整体上变化最小。在梯度2时的La3+、Y3+、Ce4+元素处理下短叶对齿藓MDA含量分别比对照显著降低44.37%、45.87%、45.53%。3种稀土元素间，差异大小变化为Ce4+>La3+>Y3+，表明Ce4+元素胁迫下，短叶对齿藓膜脂过氧化程度较高，细胞膜系统结构和功能受伤害程度重，而La3+和Y3+胁迫影响较轻。

图2 不同稀土元素不同浓度处理下短叶对齿藓的MDA含量(平均值±标准误)Fig.2 Effects of different rare earth elements treatments on MDA(mean±SE)

2.3 稀土元素对短叶对齿藓叶绿素含量的影响

图3 不同稀土元素不同浓度处理下短叶对齿藓的叶绿素含量(平均值±标准误)Fig.3 Effects of different rare earth elements treatments on chlorophyll content(mean±SE)

总体上看，轻稀土元素Ce4+和La3+在1.8×10-2～3.6×10-2mmol·L-1时可以显著促进叶绿素a含量的增加，而La3+元素在较低浓度1.8×10-2mmol·L-1时还可以显著地促进叶绿素b和总叶绿素含量的增加。重稀土元素Y3+对叶绿素的含量影响则不明显。双变量相关分析中：浓度是自变量，叶绿素a的相关系数为-0.537，双侧显著性为0，说明浓度和叶绿素a呈极显著负相关；总叶绿素的相关系数为-0.211，显著性为0.036，说明浓度和总叶绿素间存在显著负相关；POD的相关系数为-0.302，显著性为0.003，说明浓度和POD呈极显著负相关。

综合图1～3可以看出：梯度稀土元素胁迫处理对短叶对齿藓组培苗3个生理指标的影响呈以下规律：POD活力变化与MDA含量的变化表现一致，呈现先降低后升高然后又降低的趋势；Ce4+元素在3.55×10-2mmol·L-1时显著提高了POD活力；Ce4+元素也在7.1×10-2mmol·L-1时显著增加了细胞膜脂过氧化反应的主要产物丙二醛MDA的含量，呈现出一致性；这两个指标与叶绿素(a、b和总叶绿素)含量的变化呈现出相反的趋势：即叶绿素含量变化为随着稀土浓度的增加先升高后降低。这反映出稀土元素对植物生长的双向影响作用：即在低浓度条件下为植物提供营养，促进叶绿素合成并降低POD活性和MDA含量；而在较高的稀土浓度条件下，则对植物表现为逆境胁迫，会减少叶绿素的合成并提高POD酶活性，同时增加MDA含量，借以缓解和抵抗逆境胁迫对植物体造成的损害。

3 讨论

植物进行正常生长时，体内也会产生大量活性氧，但不会对植物造成伤害，因为其产生与清除始终相对平衡。稀土元素能够改变膜的透性，使得次生代谢产物快速的分泌到培养基中[15]。研究报道，La3+在低浓度内(1～10 μmol·L-1)促进根部生长，增强过氧化物酶活性和硝酸还原酶活性[10]。本研究中La3+元素在3.6×10-2mmol·L-1～7.2×10-2mmol·L-1时POD活性最强，当超过1.44×10-1mmol·L-1时酶活性显著降低，与Song W等人的研究结果一致[10]。

短叶对齿藓MDA含量在各浓度下都是Ce4+>La3+>Y3+，与POD活力呈现一致的变化，膜脂过氧化程度越强产物MDA含量就越高，消耗的酶活力也越大。短叶对齿藓细胞膜对Ce4+元素的胁迫抵抗程度大于La3+和Y3+。

苔藓中的稀土元素最初主要受到当地土壤特性的影响，如：有机物含量，可以与周边环境中阳离子进行交换，从而增加pH，研究显示苔藓与土壤相比具有一致的岩石信号并存在明显的稀土元素分级[16]。重金属铅在大气沉降中的浓度与苔藓土壤表面的一致，存在强烈的相关性[17]。稀土元素在苔藓植物体内的含量排序与在基质土壤中的排序一致，均呈现Ce>La>Nd>Y>Pr>Sm>Gd>Dy>Er>Eu,Yb>Ho，Tb>Lu[16]，而本研究通过3个生理指标研究发现Ce4+对短叶对齿藓的胁迫影响较大，La3+和Y3+元素影响较小。苔藓吸收大多数的金属元素直接来源于降水和干沉积，如：降雨、径流、尘埃[18]。苔藓有能力积累高浓度的稀土元素，因为它们有不同的途径去吸收和积累金属离子，如通过底层基质土壤或大气中的金属颗粒物沉降[16]，从而可以利用苔藓进行生物监测和生物修复。