过氧化氢缓解裸燕麦幼苗低温胁迫的主成分和隶属函数分析

刘建新 欧晓彬 刘秀丽 王金成

(1.甘肃省高校陇东生物资源保护与利用省级重点实验室,庆阳 745000； 2.陇东学院生命科学与技术学院,庆阳 745000)

裸燕麦(AvenanudaL.)为起源于中国的禾本科(Gramineae)裸燕麦属(Avena)一年生草本植物，在植物学分类上是一个独立的物种[1]，具有喜阴凉、耐盐抗旱和生长期短的生物学特性。裸燕麦籽粒营养价值高，必需氨基酸组成平衡，是我国西北、西南和华北等省区广泛种植的一种小杂粮作物，年种植面积约1 600万hm2[2]。裸燕麦喜凉爽但不耐寒，幼苗能忍受-4～-2℃的低温。我国北方常见的倒春寒气候是影响该区裸燕麦幼苗生长发育的重要制约因素。因此，探索提高裸燕麦耐冷性的技术措施对其高产优质栽培具有重要意义。

过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)是生物细胞代谢过程中产生的一种活性氧(reactive oxygen species,ROS)，高浓度时对细胞具有毒害作用，但低浓度的H2O2是植物应答多种逆境响应的信号分子，它能够增强植物对逆境的适应能力[3]。近年来，关于H2O2提高植物抗冷性方面的作用研究备受关注。研究表明，H2O2作为信号分子促进低温层积下细枝岩黄耆(Hedysarumscoparium)种子的萌发[4]，诱导香蕉(Musanana)果实采后的抗冷性[5]。外源H2O2处理能够缓解低温对柑橘(Citrusreticulata)叶片细胞膜的伤害[6]，增强水稻(Oryzasativa)幼苗的抗寒性[7]，提高绿豆(Vignaradiata)幼苗[8]和直播油菜(Brassicacampestris)苗期[9]耐低温胁迫的能力，减轻低温胁迫对结缕草(Zoysiajaponica)和细叶结缕草(Zoysiatenuifolia)的氧化伤害[10]。低温导致植物生长受抑和细胞质膜发生氧化损伤[11]，而抗氧化防御系统和渗透溶质积累与植物抵御低温伤害密切相关[12]。外源H2O2能够提高低温胁迫下油菜种子萌发过程和幼苗叶片中的抗氧化酶活性和非酶抗氧化物质含量，降低ROS积累引发的膜脂氧化损伤[13～14]，缓解低温对油菜苗期生长的抑制效应[9]，提高低温胁迫香蕉(Musanana)幼苗可溶性糖的含量[15]，从而增强其耐低温的能力。然而，这些研究以多个单项指标的变化来分析H2O2对植物耐冷性的影响，其评价存在片面性。主成分和隶属函数分析提供了一种多指标综合评价的方法，能够客观和全面地对植物抗逆性进行评价[16～17]。为明确H2O2对甘肃省主栽裸燕麦新品种‘定莜6号’耐冷性是否具有提升作用，本试验采用珍珠岩沙培幼苗，通过叶面喷施H2O2预处理后模拟甘肃中部裸燕麦种植区常年多出现的低温条件8℃/5℃(昼/夜)进行低温胁迫处理，观察幼苗生长状况并检测叶片中活性氧代谢和渗透溶质积累的变化，通过主成分和隶属函数分析综合评价H2O2对裸燕麦幼苗耐冷性的影响，以期为应用H2O2减轻裸燕麦低温胁迫伤害提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

精选饱满一致的‘定莜6号’裸燕麦种子经3% NaClO表面消毒15 min后用自来水冲洗、风干，均匀摆放约200粒种子于铺有薄层珍珠岩的直径12 cm培养皿中，然后再用珍珠岩覆满培养皿，加10 mL自来水后盖上培养皿盖在人工气候箱中25℃/16℃(昼/夜)萌发，培养皿共180个，每天补充适量自来水以满足萌芽和生长需要，幼苗2叶1心期浇1次Hoagland营养液，幼苗培养至3叶期时进行低温处理。人工气候箱湿度为60%～70%，光照强度400 μmol·m-2·s-1，昼/夜光周期为14 h/10 h。所用30% H2O2分析纯为上海莲冠生物化工有限公司产品。

1.2 试验设计

将180个培养皿中用珍珠岩培养的3叶期裸燕麦幼苗每皿浇10 mL Hoagland营养液后分成两组，每组90个，一组叶面喷施蒸馏水作为对照(CK)，另一组喷施10 μmol·L-1H2O2(为预实验中根据膜脂过氧化产物变化筛选的适宜浓度)。为降低表面张力，喷施液中加3滴吐温-80。喷施量以滴液为限，每皿约5 mL。喷施每4 h进行1次，共喷2次，喷施结束后先在正常温度(昼/夜25℃/16℃)下培养12 h以使H2O2被叶片充分吸收，然后转入昼/夜为8℃/5℃的人工气候箱中进行低温胁迫，光照度400 μmol·m-2·s-1、相对湿度60%～70%，光周期14 h/10 h(昼/夜)。处理期间每天向每个培养皿内补充5 mL Hoagland营养液。分别在低温处理的第0、1、2、3、4、5 d取幼苗叶片，用液氮速冻后-70℃保存，用于测定相关生理指标。低温处理5 d后测定植株株高和生物量增量。每组处理3次重复，随机排列，每天交换在气候箱中的位置以保证光照条件的一致。

1.3 测定指标与方法

1.3.1 株高和生物量增量

株高增量Δh(cm)=低温胁迫5 d后株高(h2)-低温胁迫前株高(h1)。分别于低温胁迫前和低温胁迫5 d后取100株幼苗，洗净并吸干表面水分后，在105℃杀青30 min后，70℃下烘至恒重，电子天平称重。生物量增量△m(g)=低温胁迫5 d天后生物量(m2)-低温胁迫前生物量(m1)。

1.3.2 活性氧和膜脂过氧化产物

1.3.3 抗氧化系统活性

超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性及抗坏血酸(AsA)和谷胱甘肽(GSH)含量测定均采用陈建勋和王晓峰[21]的方法。

1.3.4 渗透调节物质

按李合生[20]的方法测定可溶性糖和脯氨酸含量；用曾韶西等[22]的方法测定可溶性蛋白质和热稳定性蛋白质含量。

1.4 数据处理与统计分析

13项生理指标测定均重复3次，结果以每克鲜重材料为基础计算。为了综合评价H2O2对低温胁迫裸燕麦幼苗生理特性的影响，首先对各指标原始数据按公式(1)离差标准化，然后进行主成分分析提取4个主成分因子，将4个主成分的得分系数乘以各自标准化的原始变量求和得到各处理的综合指标值[16]，根据公式(2)计算各处理综合指标值的隶属函数值U(Xj)，按公式(3)计算得到4个综合指标的权重Wj分别为0.493、0.241、0.144、0.122，再根据公式(4)计算各处理的隶属函数综合评价值D。各单项指标和隶属函数综合评价值均采用SPSS20.0软件单因素方差分析和Duncan法多重比较(P<0.05)。

(1)

U(Xj)=(Xj-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(2)

式中：Xj表示第j个综合指标；Xmin表示第j个综合指标的最小值；Xmax表示第j个综合指标的最大值。

Wj=Pj/∑Pj

(3)

式中：Wj表示第j个综合指标在所有综合指标中的重要程度；Pj为各处理组第j个综合指标的贡献率。

D=∑[U(Xj)×Wj]

(4)

式中：D值越大，植株耐低温的能力越强。

2 结果与分析

2.1 H2O2对低温胁迫下裸燕麦幼苗生长的影响

从图1可见，与CK相比，H2O2处理显著提高了裸燕麦幼苗在低温胁迫下的株高增量和生物量增量，增幅分别为33.3%和30.1%。

图1 H2O2对低温胁迫裸燕麦株高和生物量增量的影响Fig.1 Effect of H2O2 on the height increment and biomass increment of naked oat seedlings under low temperature stress

图2 H2O2对低温胁迫下裸燕麦幼苗叶片和MDA含量的影响 不同字母表示处理间5%水平差异显著，下同。Fig.2 Effect of H2O2 on the contents of and MDA in leaves of naked oat seedlings under low temperature stress The different letters in the figure indicate significant differences at P<0.05,the same as below.

2.2 H2O2对低温胁迫下裸燕麦幼苗叶片和MDA含量的影响

2.3 H2O2对低温胁迫下裸燕麦幼苗叶片SOD、CAT、POD、APX活性及AsA和GSH含量的影响

图3显示，随着低温胁迫时间的延长，H2O2处理的裸燕麦叶片SOD活性呈降——升——降——升变化，CAT活性不断提高，POD活性和AsA含量先升后降，APX活性呈降——升——降变化，GSH含量呈升——降——升——降波峰变化；而CK裸燕麦叶片SOD活性和GSH含量呈升——降——升趋势，CAT活性逐渐增加，POD活性和AsA含量呈先升后降变化，APX活性迅速下降后保持稳定。与CK相比，H2O2处理的裸燕麦叶片SOD活性除低温胁迫第2和3 d差异不明显外，低温胁迫第0、1、4、5 d的SOD活性明显升高，增幅为19.7%～312.6%；CAT活性除低温胁迫第2和4 d时两处理无明显差异外，其余低温胁迫时间均H2O2处理显著高于CK，增幅为9.1%～35.7%；POD活性在低温胁迫第1 d时H2O2处理与CK差异不显著，其它低温胁迫时间均H2O2处理显著高于CK，增幅为40.5%～123.7%；APX活性在低温胁迫第1、4和5 d时H2O2处理与CK相比变化不大，低温胁迫第0 d时H2O2处理的APX活性明显下降，而在低温胁迫第2和3 d时H2O2处理的APX活性显著高于CK，增幅为12.9%～23.4%；AsA含量在低温胁迫第1～3 d H2O2处理与CK差异不明显，低温胁迫第3～5 d H2O2处理明显高于CK，增幅达36.0%～64.8%；GSH含量在整个低温胁迫的第0～5 d H2O2处理均显著高于CK，增幅为38.2%～257.6%。

2.4 H2O2对低温胁迫下裸燕麦幼苗叶片可溶性糖、脯氨酸、可溶性蛋白质和热稳定性蛋白质含量的影响

从图4可以看出，随着低温胁迫时间的延长，CK和H2O2处理的裸燕麦叶片可溶性糖和脯氨酸含量逐渐提高，可溶性蛋白质和热稳定性蛋白质含

图3 H2O2对低温胁迫下裸燕麦幼苗叶片SOD、CAT、POD、APX活性及AsA和GSH含量的影响Fig.3 Effect of H2O2 on the SOD,CAT,POD and APX activities and AsA, GSH contents in leaves of naked oat seedlings under low temperature stress

Table1Eigenvalue,variancecontributionandcumulativevariancecontributionofprincipalcomponentanalysisofphysiologicalindicatorinnakedoatseedlingleaves

成分Component12345678910111213特征值Eigen value5.482.691.601.360.650.550.320.230.060.030.020.010.00贡献率Variance contribution(%)42.1920.6612.3210.444.974.202.481.740.460.260.130.110.03累积贡献率Cumulative variance contribution(%)42.262.875.285.690.694.897.399.099.599.799.9100.0100.0

图4 H2O2对低温胁迫下裸燕麦幼苗叶片可溶性糖、脯氨酸、可溶性蛋白质和热稳定性蛋白质含量的影响Fig.4 Effect of H2O2 on the contents of soluble sugar,proline,soluble protein and heat stable protein in leaves of naked oat seedlings under low temperature stress

量不断增加，低温胁迫第5 d时转而下降，但仍高于低温胁迫第0 d的含量。与CK相比，H2O2处理的裸燕麦叶片可溶性糖含量除低温胁迫第0和3 d差异不显著外，其它低温胁迫时间H2O2处理均高于CK，增幅为15.6%～35.0%；H2O2处理的裸燕麦叶片脯氨酸和可溶性蛋白质含量在整个低温胁迫的第1～5 d均高于CK，增幅分别为15.3%～63.7%和4.7%～22.2%；热稳定性蛋白质含量在低温胁迫第0～3 d H2O2处理与CK差异不明显，低温胁迫第4～5 d H2O2处理明显高于CK，增幅达5.2%～9.4%。

2.5 H2O2缓解裸燕麦幼苗低温胁迫的主成分分析和隶属函数综合评价

从4个主成分计算所得的各处理隶属函数综合评价值D如图5所示：无论是H2O2处理还是未经H2O2处理的CK，裸燕麦幼苗耐低温的综合评价值D均随低温胁迫时间延长显著提高；但与CK相比，H2O2处理的裸燕麦幼苗在低温胁迫5 d内的D值均显著高于CK。

图5 H2O2处理对低温胁迫裸燕麦幼苗综合评价值D的影响Fig.5 Effect of H2O2 on comprehensive score(D) of naked oat seedlings under low temperature stress

3 讨论

3.1 H2O2对低温胁迫下裸燕麦幼苗叶片活性氧代谢的影响

3.2 H2O2对低温胁迫下裸燕麦幼苗叶片渗透调节物质含量和生长量的影响

低温胁迫下，胞质会趋向积累渗透调节物质来维持细胞膨压，缓解胁迫对植物的伤害[22～23]。可溶性糖、脯氨酸和可溶性蛋白质是植物细胞重要的渗透调节物质[27]。前人研究表明，外施H2O2能够提高低温胁迫下黄瓜幼苗可溶性蛋白质[28]、香蕉可溶性糖[15]含量，缓解低温对细胞的伤害。本试验表明，在低温胁迫的0～5 d内，外源H2O2总体上显著提高了裸燕麦幼苗叶片可溶性糖、脯氨酸、可溶性蛋白质和热稳定性蛋白质含量(图4)，与外源H2O2预处理能够增加低温胁迫下水稻可溶性糖、可溶性蛋白质和脯氨酸含量[7]的研究结果一致。细胞渗透调节物质的提高，有利于维持或降低细胞渗透势，维持细胞膨压，防止细胞过度失水或使冰点下降；同时还可保护蛋白质结构、稳定细胞器功能和减轻低温对生物膜结构的破坏。表明外施H2O2可以通过增强渗透溶质积累，提高裸燕麦幼苗对低温的适应能力。

生长量是植物在逆境下生理变化的综合反映，也是植物抗逆能力的直接表现。本试验结果表明，与CK相比，外施H2O2显著提高了裸燕麦幼苗在低温胁迫下的株高增量和生物量增量(图1)，这与外源H2O2能够缓解低温胁迫对苗期油菜生长抑制[9]的结果一致。其原因可能与外源H2O2能够提高低温胁迫下裸燕麦幼苗抗氧化系统活性(图3)、减轻低温诱导的活性氧对膜质的氧化伤害(图2)以及细胞渗透调节能力增强(图4)有关。说明外源H2O2可以通过调节裸燕麦活性氧代谢和渗透溶质积累，缓解低温对裸燕麦生长的抑制效应，从而增强其对低温的耐性。

3.3 H2O2缓解裸燕麦幼苗低温胁迫伤害的综合评价

4 结论

喷施10 μmol·L-1H2O2可显著提高低温胁迫下裸燕麦幼苗叶片抗氧化系统防御能力和渗透调节物质含量，缓解低温造成的活性氧积累对细胞膜脂的氧化损伤和幼苗生长抑制。通过主成分分析和隶属函数综合评价表明H2O2能够增强裸燕麦幼苗的耐冷性。