大叶性肺炎患儿外周血细胞间黏附分子1和肺泡灌洗液RANTES检测及其意义

张松林， 靳秀红， 沈照波

儿童大叶性肺炎是社区获得性肺炎较常见的疾病类型之一[1]，其发病率近几年呈上升趋势[2-3]，其临床起病急，病程长，病情重，并发症多，治疗费用高、严重危害儿童身体健康[4]。儿童大叶性肺炎可由多种致病原感染引起，进而引发多种炎症介质及细胞因子参与，是呈大叶性分布的急性肺泡炎性病变，具体发病机制尚未明了。目前儿童纤维支气管镜技术已逐渐广泛应用于小儿呼吸系统疾病的诊断及治疗中[5-6]，甚至在新生儿期也可应用[7]，且可显著提高临床诊治水平及疗效，本研究应用儿童纤维支气管镜技术采取大叶性肺炎患儿肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)进而检测其趋化因子的表达水平。黏附分子和趋化因子是参与多种细胞炎症反应和免疫应答的两大类重要的生物活性因子。本研究旨在检测外周血细胞间黏附分子1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)(CD54)和肺泡灌洗液调节激活正常T细胞表达和分泌的细胞因子(regulated on activation，normal T cell expressed and secreted，RANTES)在大叶性肺炎患儿体内的表达水平，进而分析它们之间的相关性，以探讨其在大叶性肺炎发病机制中的可能作用和临床价值，为临床更好的诊治大叶性肺炎提供理论基础和依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2015年7月至2016年12月郑州儿童医院呼吸科收治住院的呼吸系统疾病患儿95例为研究对象。按临床诊断分为大叶性肺炎组35例，支气管肺炎组30例和气管狭窄组(对照组)30例。大叶性肺炎组中男20例，女15例；年龄1～12岁，平均(4.5±2.2)岁；支气管肺炎组中男17例，女13例；年龄1～10岁，平均(3.6±2.6)岁，患儿经胸部64排CT加气道重建诊断为支气管肺炎伴气管狭窄，需行纤维支气管镜明确气管狭窄性质；气管狭窄组中男14例，女16例；年龄1～8岁，平均(2.8±1.8)岁，患儿经胸部64排CT加气道重建诊断气管狭窄(非肺炎)，需行纤维支气管镜明确气管狭窄性质。3组患儿在年龄、性别方面比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 诊断标准 参照《诸福棠实用儿科学》[8]和《儿童胸部疾病影像诊断》[9]中的大叶性肺炎、支气管肺炎、气管狭窄的诊断标准。

1.3 纳入标准 (1)符合大叶性肺炎、支气管肺炎、气管狭窄的诊断标准；(2)年龄1～12岁；(3)患儿家属知情同意。

1.4 排除标准 (1)全身应用糖皮质激素者；(2)结核、真菌、寄生虫等特殊病原引起的大叶性肺炎者。

1.5 方法

1.5.1 主要试剂及仪器 鼠抗人CD54-PE(BioLegend公司)；RANTES试剂盒(上海吉泰依科赛生物科技有限公司)；流式细胞仪FACScan(BD公司)；Olympus BFXP60型电子纤维支气管镜(日本Olympus公司)。

1.5.2 实验方法 (1)外周血采集：所有患儿均于入院次日晨起空腹4 h抽取外周静脉新鲜全血1 mL，乙二胺四乙酸二钠抗凝后上流式细胞仪待用；(2)肺泡灌洗液标本采集：所有患儿均于入院3 d内行纤维支气管镜肺泡灌洗术，术前禁食水4～6 h，术前30 min肌注阿托品0.02 mg/kg，抑制呼吸道腺体分泌；术前5 min静脉注射咪达唑仑0.2 mg/kg镇静；电子纤维支气管镜经鼻、咽喉、声门进入气道，依次检查各段支气管有无新生物和其他病变后，结合术前胸部CT的定位结果，寻找大叶性肺炎病变部位或者气管狭窄部位的支气管开口，应用37 ℃温生理盐水1.0 mL/kg灌洗受累肺段至少3次，随即负压吸引，留取肺泡灌洗液标本，缓慢拔出电子纤维支气管镜。留取3 mL肺泡灌洗液标本于一次性无菌硅化管中储存于-80 ℃冰箱中，备用待测；(3)外周血淋巴细胞ICAM-1检测：采用流式细胞术应用流式细胞仪收获细胞，用Cell Quest Plot软件程序分析数据并获取ICAM-1表达率；(4)肺泡灌洗液RANTES浓度的检测：采用ELISA法，按照试剂盒说明书操作，获取肺泡灌洗液RANTES的表达水平。

2 结果

2.1 3组患儿ICAM-1表达情况和RANTES水平比较 见表1。

表1 3组儿童ICAM-1和RANTES检测结果

注：与气管狭窄组比较，aP<0.05，bP<0.01；与大叶性肺炎组比较，cP<0.05。

表1结果表明，大叶性肺炎组ICAM-1表达率显著高于支气管肺炎组及气管狭窄组，支气管肺炎组ICAM-1表达率显著高于气管狭窄组，差异有统计学意义(P<0.05)。大叶性肺炎组和支气管肺炎组肺泡灌洗液RANTES水平均显著高于气管狭窄组，差异有统计学意义(P<0.05)，大叶性肺炎组与支气管肺炎组间RANTES水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 ICAM-1与RANTES相关性分析 大叶性肺炎组ICAM-1与RANTES呈正相关(r=0.781，P<0.01)，支气管肺炎组和气管狭窄组ICAM-1与RANTES无相关性。

3 讨论

儿童大叶性肺炎常发病于3岁以上年长儿，但婴幼儿亦可发病，可由多种致病原，如肺炎链球菌、肺炎支原体[10]、病毒、真菌等等，感染引起的进而激发机体多种炎症介质及细胞因子参与，发生强烈的机体炎症反应，从而引发一个肺叶，或者多个肺叶，甚至一个或多个肺段范围内的急性肺泡炎性病变的气道炎症反应性疾病。当肺泡炎性病变不能得到及时有效的控制时，可导致单个或多个肺叶、肺段的大片状炎性病变，从而形成肺实变或者合并胸腔积液、肺脓疡、气胸、液气胸、胸膜炎等并发症，甚至引发其他肺外并发症，如脑梗死、脾梗死、眼底病变等，严重影响儿童健康。

儿童大叶性肺炎的发病机制较为复杂，目前尚未明了，多种细胞因子参与其发病过程。其中ICAM-1是黏附分子免疫球蛋白超家族成员之一，其分布较为广泛，生理状态下表达甚少，但在γ干扰素、白细胞介素1、内毒素等细胞因子的作用下，ICAM-1亦可广泛表达于呼吸道上皮细胞、外周血淋巴细胞、血管内皮细胞等细胞表面，具有促进气道炎症反应、参与免疫反应与调节、诱导免疫细胞发育和分化、调节免疫细胞凋亡等多种生物学功能。ICAM-1与其配体相互作用，亦可增强T细胞对抗原物质刺激的敏感性，增加细胞间接触的稳定性，诱导B细胞向浆细胞转化而分泌抗体，在T细胞和B细胞激活与调节中均发挥着重要的作用。目前研究发现，黏附分子可以参与炎症反应的整个过程，如ICAM-1通过与其配体巨噬细胞表面分子抗原(CD11b/CD18)和淋巴细胞功能相关抗原1(CD11a/CD18)相结合的方式，进而促进多种炎症细胞和血管内皮细胞之间的初次黏附、稳定黏附及白细胞的附壁，引发一系列相关性级联反应，促使炎症细胞的空间结构重排以及炎症细胞的活化，定向迁移，穿越血管内皮细胞和基质，向炎症部位移行等过程。ICAM-1表达水平的高低可以直接影响参与炎症反应中白细胞数量的多少，可见ICAM-1在炎症反应中发挥着重要的生物学作用，已有研究报道ICAM-1在毛细支气管炎的炎症反应中发挥着重要作用[11]。而且，目前研究表明，炎症反应的分子细胞学机制就是基于白细胞与血管内皮细胞表面黏附分子的相互作用，以及细胞因子等对黏附分子表达的调节。目前研究还发现ICAM-1与LAF-1的结合及其相互间作用可诱导淋巴细胞与上皮细胞的黏附及部分中性粒细胞、单核巨噬细胞与上皮细胞的黏附，抗ICAM-1和抗LAF-1的单克隆抗体可阻断这些细胞间的黏附。Stanciu等[12]曾报道ICAM-1在炎症细胞与血管内皮细胞和上皮细胞黏附完成跨内皮和穿过上皮的过程中均起到重要的作用。ICAM-1的表达率在大叶性肺炎患儿中是否异常增高，目前国内外尚未见报道。本研究采用流式细胞术方法检测大叶性肺炎患儿外周血淋巴细胞表面ICAM-1的表达率，结果显示，大叶性肺炎组表达率高于支气管肺炎组和气管狭窄组，支气管肺炎组高于气管狭窄组，提示ICAM-1可引导淋巴细胞等炎症细胞穿越血管内皮细胞和基质并且最终黏附于支气管内皮细胞上起重要的作用，表明ICAM-1参与了大叶性肺炎和支气管肺炎的炎症反应，并且大叶性肺炎的炎症反应强度较支气管肺炎更为剧烈，并可作为临床评定大叶性肺炎气道炎症反应程度的较客观的实验指标。

而RANTES属于CC趋化因子亚家族成员之一，它通过趋化炎症细胞以及调节这些细胞的功能从而在炎症免疫反应应答中发挥着重要的作用。RANTES除了对细胞迁移的影响外，还能活化T细胞、中性粒细胞、自然杀伤细胞及单核细胞等，参与炎症反应过程。RANTES对多种不同种类的细胞都具有强烈的趋化作用，其通过趋化诱导淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、单核细胞等细胞的定向趋化游走，介导细胞在炎症部位募集、活化，促使炎症细胞在内皮细胞上黏附，激活和诱导T细胞的增殖，因而，RANTES是参与炎症反应性疾病中具有重要作用的趋化因子之一。目前在体外研究也发现，CC趋化因子(如RANTES)能够迅速使嗜碱性粒细胞脱颗粒释放组胺，趋化因子的这种作用可能与非IgE介导的组织损伤及炎症反应有关联，目前具体机制尚未明了[13]。RANTES在炎症反应过程中的作用贯穿于炎症细胞与血管内皮细胞相互作用的整个过程，它的产生亦是炎症反应的特征之一[14]。RANTES能够趋化诱导炎症细胞并向特定组织部位浸润和聚集，至少通过两种作用机制发挥趋化作用，首先是直接的趋化作用，其次是使炎症细胞因子与它们的受体在内皮细胞上相互结合而起到间接的趋化作用。本研究中，大叶性肺炎组肺泡灌洗液RANTES水平高于气管狭窄组，支气管肺炎组高于气管狭窄组，但大叶性肺炎组和支气管肺炎组间的差异无统计学意义，提示RANTES可能是通过趋化炎症细胞募集到气道上皮，参与了气道的炎症反应过程，在大叶性肺炎和支气管肺炎的炎症反应过程中均起重要的作用，且研究还发现应用Met-RANTES可封闭RANTES受体，阻断其炎症反应过程[15]，为我们今后可能临床应用Met-RANTES治疗大叶性肺炎提供了新的思路。目前研究还发现，RANTES等趋化因子可刺激诱导黏附分子整合素的活化及其水平的上调，介导炎症细胞在血管内皮附壁，进而游走到局部组织参与炎症反应过程[16]。本研究中也发现大叶性肺炎组RANTES与ICAM-1相关性研究分析表明它们呈正相关，提示两者通过趋化黏附炎症细胞在大叶性肺炎发病机制中起相互协同作用，与既往相关理论研究相符。

总之，本研究表明，我们可以通过检测大叶性肺炎患儿外周血淋巴细胞ICAM-1及其肺泡灌洗液RANTES表达水平，可作为评定大叶性肺炎患儿体内炎症反应程度较客观的临床实验指标，二者的异常表达可能是儿童大叶性肺炎发生发展的重要发病机制之一。理论上我们可以通过免疫调节法(如抗RANTES抗体、ICAM-1单克隆抗体等)或Met-RANTES治疗儿童大叶性肺炎，以缩短其病程，减少其并发症的发生，减轻患儿痛苦，但其可行性仍需我们进一步深入研究。