miR-127-3p通过下调靶基因MAPK4抑制神经胶质瘤增殖的机制研究

颜洋 韩美文 汪应瑞

神经胶质瘤(Glioma)起源于外胚层中神经胶质细胞，是中枢神经系统最常见的致死性恶性肿瘤，约占颅内恶性肿瘤的50%[1]。神经胶质瘤好发于成人，肿瘤细胞呈弥漫性生长、侵袭性高、无明确边界，神经胶质瘤患者的5年生存率低于10%，严重危害人类生命健康[2-3]。神经胶质瘤细胞恶性生物学特性是导致临床上神经胶质瘤患者治疗困难的根本原因之一[4]，因此深入研究神经胶质瘤基因遗传学改变特点及寻找可能的基因治疗靶点，对神经胶质瘤的诊断和治疗具有重大意义。近年来，微小RNA(miRNA)在人类多种恶性肿瘤发生发展中的作用和机制逐渐得到人们的重视。已经明确多种miRNA同样参与了神经胶质瘤细胞生物行为学的调控。

miR-127与miR-136、miR-432等同属1个miRNA簇，位于人类染色体14q32.31上，其前体基因可表达为miR-127-3p和miR-127-5p两种成熟的miRNA[5]。miR-127可能对肿瘤起着抑制作用，如miR-127在前列腺癌、膀胱癌、宫颈癌等多种癌症中表达下调，miR-127能通过靶基因COA1和PDIA6抑制巨细胞基质细胞(GCTSC)的增殖[6]。多项研究表明，miR-127在神经胶质瘤中呈低表达[7-8]，但miR-127在神经胶质瘤细胞中的调控作用尚不清楚。本研究拟探讨miR-127对神经胶质瘤细胞增殖、凋亡的生物学作用及其可能的靶基因，以期为神经胶质瘤细胞的诊断和治疗提供新的理论依据。

1 资料与方法

1.1 病例收集 收集2013年3月-2016年9月本院17例神经胶质瘤患者和15例健康人群脑脊液，所有患者及健康人群均签署知情同意书，将穿刺获取的脑脊液快速置于液氮保存，以备后续检测所用。本实验部分获得本院伦理委员会批准实施。神经胶质瘤患者纳入标准：①诊断标准参照《中国中枢神经系统胶质瘤诊断与治疗指南(2015)》[9]；②所有患者均经术后病理确诊。排除标准：① 复发病例；② 保守治疗患者；③ 合并有严重心、肺、肝、肾等脏器严重损坏患者。

1.2 细胞培养与转染 人神经胶质瘤细胞株U251、U373、U87、SHG44和人脑正常胶质细胞株HEB购自中科院，DMEM培养基、RPMI-1640培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素、细胞培养瓶、细胞培养板、MTT试剂、DMSO、凋亡试剂盒等材料均购于碧云天生物有限公司，Lipofectatime 2000(Invitrogen产品)、miR-127-3p mimics和阴性对照物、野生型和突变型MAPK4基因3′UTR荧光素酶表达载体等均购于广州锐博生物有限公司。Trizol试剂(Invitrogen)、逆转录试剂盒(TOYOBO)、PCR试剂盒(TOYOBO)等购自上海吉马公司，蛋白制胶试剂盒、PVDF膜、电泳等所用化学分析试剂均购于武汉谷歌生物有限公司。兔抗人一抗(Bcl-2、Caspase-3、MAPK4)和山羊抗兔IgG二抗 (HRP)均购于武汉三鹰公司。人神经胶质瘤细胞株U251、U373、U87、SHG44均采用DMEM(含有胎牛血清和双抗)培养，人脑正常胶质细胞株HEB采用RPMI-1640培养基(含有胎牛血清和双抗)培养，培养条件为37℃和5%CO2。取U251做瞬时转染，当U251细胞汇合率达到60%～70%时根据说明书加入转染试剂、miR-127-3p mimics或阴性对照物进行瞬时转染，24 h后更换培养基继续培养并完成下一步实验。

1.3 MTT实验 将人神经胶质瘤细胞U251种植于96孔板中，根据转染miR-127-3p mimics水平设置3个实验组：50组(转染水平为50 nmol/L)、100组(转染水平为100nmol/L)、150组(转染水平为150 nmol/L)，并设置对照组(转染miR-127-3p的阴性对照物)。每组设置5个复孔。以转染的时间为起点(0 h)，分别在转染后24、48、72 h采用MTT实验检测各组细胞的增殖。MTT检测简要概括如下：培养结束后在每孔中加入20 mL的5 mg/L的MTT试剂，置于37 ℃中孵育4 h，然后吸去培养基，每孔中加入150 mL的DMSO试剂，室温避光条件下置于振荡器上震荡10 min，然后在酶标仪上上机检测，测定570nm波长处的吸光度值。

1.4 流式细胞术检测凋亡 各组细胞在6孔板中转染结束后吸去培养基，用PBS清洗1遍，用胰蛋白酶消化细胞并收集单细胞悬液，用PBS清洗2遍。按照碧云天Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒说明书1次加入试剂，采用流式细胞仪上机检测各组细胞早期凋亡和晚期凋亡情况。

1.5 荧光定量PCR Trizol法提取组织或者细胞的总RNA，检测RNA质量，进行Poly加尾处理，采用TOYOBO公司逆转录试剂盒ReverTra Ace qPCR RT Kit逆转录合成cDNA，然后采用TOYOBO公司SYBR Green Realtime PCR Master Mix上机(实时荧光定量PCR仪，ABI7500，美国)进行荧光定量PCR检测。miR-127-3p以U6作为内参。miR-127-3p上游引物5′-GGAAGATCTGTAGTCCTGTCTGTTGGTCAG-3′，下游引物5′-CCCAA GCTTCCTGAAGAACTGCTTCCGCC-3′， U6上游引物5′-GCTTCGGCA CATATACTAAAAT -3′，下游引物5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。2-△△Ct法计算每个样的mRNA相对表达水平。

1.6 蛋白印迹实验检测蛋白水平 采用RIPA试剂裂解并提取细胞总蛋白，采用碧云天BCA试剂盒测定蛋白水平，加上样缓冲液，100 ℃下蛋白变性，每孔上样量为20 μg，SDS-PAGE法电泳，电泳结束后进行转膜，将蛋白通过电转到PVDF膜上；5%脱脂牛奶封闭2 h，TBST洗脱3遍，孵一抗过夜，TBST洗脱3遍，孵二抗2 h，TBST洗脱3遍，最后在暗室中在X线胶片上显影和定影，然后进行蛋白半定量灰度值分析。

1.7 双荧光素酶报告基因实验 采用在线靶基因预测数据库Targetscan、miRanda预测miR-127-3p的靶基因，结合已发表的文献研究，确立MAPK4为miR-127-3p的可能靶基因。采用双荧光素酶报告基因实验进一步验证。构建突变型和野生型MAPK4基因3′UTR荧光素酶表达载体(MUT-3′UTR、WT-3′UTR)，并将其分别与miR-127-3p mimic或miR-127-3p阴性对照物，采用Lipofectatime 2000共同转染入U251细胞，通过荧光素酶报告基因检测仪检测各组细胞荧光素酶的活性来鉴定MAPK4是否为miR-127-3p的直接作用靶点。

1.8 统计学处理

2 结 果

2.1 miR-127-3p在脑脊液中的表达水平

神经胶质瘤患者(1.33±0.12)脑脊液中的miR-127-3p相对表达水平低于健康人群(3.62±0.26)(t=5.867，P=0.004)。

2.2 miR-127-3p在细胞系中的表达水平

U251(0.59±0.05)、U373(0.96±0.08)、U87(0.77±0.03)、SHG44(1.28±0.05)中miR-127-3p相对表达水平均低于人脑正常胶质细胞株HEB(3.64±0.26)(P均<0.01)，其中U251细胞株中miR-127-3p相对表达水平最低。

2.3 miR-127-3p抑制U251细胞增殖

转染后24、48、72 h150组、100组和50组细胞吸光度值均低于对照组(P均<0.05)，并且随着miR-127-3p mimics转染水平增高，U251细胞吸光度值越低(图1)。

图1 MTT实验检测各组细胞增殖 对照组为转染miR-127-3p阴性对照物;50组为转染50 nmol/L 的miR-127-3p mimics;100组为转染100 nmol/L的miR-127-3p mimics;150组为转染150 nmol/L 的miR-127-3p mimics;与同时间点对照组比较,*P<0.05

2.4 Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡

miR-127-3p mimics转染组(39.3±4.6%)细胞早期凋亡率高于对照组(7.2±0.6%)(P<0.05)；miR-127-3p mimics转染组(9.3±2.3%)细胞晚期凋亡率高于对照组(2.4±0.5%)(P<0.05)(图2)。

图2 Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡 对照组为转染miR-127-3p阴性对照物;Mimic组为转染150 nmol/L的miR-127-3p mimics

2.5 miR-127-3p调控U251细胞凋亡相关蛋白bcl-2、bax和Mcl-1表达水平

mimic转染组(0.269±0.008)U251细胞bcl-2蛋白表达水平低于对照组(0.556±0.039)，mimic转染组(0.314±0.015)U251细胞bax蛋白表达水平高于对照组(0.086±0.006)，mimic转染组(0.144±0.009)U251细胞Mcl-1蛋白表达水平低于对照组(0.426±0.028)(P均<0.05)(图3)。

2.6 miR-127-3p靶基因预测和验证

采用在线靶基因预测数据库Targetscan、miRanda预测miR-127-3p的靶基因为MAPK4，MAPK4 mRNA 3′UTR与人miR-127-3p结合区域如图4所示。本研究根据预测结合区域序列构建了MAPK4-WT-3′UTR和MAPK4-MUT-3′UTR。双荧光素酶报告基因实验显示，只有当MAPK4-WT-3′UTR与miR-127-3p mimic共同转染时荧光素酶活性被抑制，这提示miR-127-3p能与MAPK4直接结合(图5)。

图3 Western blot检测细胞蛋白表达水平 对照组为转染miR-127-3p阴性对照物;Mimic组为转染150 nmol/L 的miR-127-3p mimics;a为Western blot实验蛋白条带图;b为Western blot实验蛋白条带灰度值比,与对照组比较,*P<0.05

图4 miR-127-3p与靶基因结合位点序列图

图5 双荧光素酶报告实验 mimic为miR-127-3p mimics;mimic-ctrl为miR-127-3p 阴性对照组;WT-3'UTR为野生型MAPK4基因3'UTR荧光素酶表达载体;MUT-3'UTR为突变型MAPK4基因3'UTR荧光素酶表达载体

2.7 miR-127-3p mimic下调U251细胞MAPK4蛋白表达水平

miR-127-3p mimic转染组(0.121±0.003)U251细胞MAPK4蛋白表达水平低于对照组(0.467±0.028)(P<0.05)(图6)。

图6 Western blot实验检测细胞MAPK4蛋白条带 对照组为转染miR-127-3p阴性对照物;Mimic组为转染150 nmol/L的miR-127-3p mimics

3 讨 论

本研究结果显示，miR-127-3p在神经胶质瘤患者脑脊液中表达水平低于健康人群，这为研究miR-127-3p与神经胶质瘤关系提供了临床依据，并且miR-127-3p可能作为神经胶质瘤诊断标志物。本研究结果与既往发表结果一致，研究者通过基因芯片及生物信息学方法研究显示，miR-127-3p在神经胶质瘤中呈现低表达[8]。本研究还通过比较人神经胶质瘤细胞株U251、U373、U87、SHG44和人脑正常胶质细胞株HEB中miR-127-3p相对表达水平，结果发现人神经胶质瘤细胞株中miR-127-3p相对表达水平均低于人脑正常胶质细胞株。此外，Jiang等[10]人研究显示，miR-127-3p在恶性胶质母细胞瘤中也呈现低表达，miR-127-3p通过激活TGF-β信号通路抑制恶性胶质母细胞瘤的增殖。因此， miR-127-3p可能在神经胶质瘤中发挥重要作用。

为深入阐述miR-127-3p在神经胶质瘤中的生物学作用，本研究采用瞬时转染miR-127-3p模拟物上调神经胶质瘤细胞U251的miR-127-3p表达水平，结果提示上调miR-127-3p能抑制U251细胞增殖且呈剂量依赖性，上调miR-127-3p还能促进U251细胞凋亡。上调miR-127-3p能抑制凋亡相关基因bcl-2、Mcl-1蛋白表达水平以及促进bax的蛋白表达水平。Bcl-2(B-cell lymphoma-2)是B淋巴细胞瘤-2基因，在神经胶质瘤细胞的凋亡过程中起着至关重要的作用[11]。Bcl-2家族成员具有高度的同源性以及具有BH1、BH2、BH3、BH4等相似的保守结构区域。Bcl-2家族成员在神经胶质瘤中并非发挥同样的作用，Bcl-2家族根据其不同功能可分为抗凋亡和促凋亡两类，抗凋亡基因主要有Bcl-2、Mcl-1、Bcl-XL和Bcl-W等，属于肿瘤细胞死亡的负向调控因子，保护神经胶质瘤细胞在化疗药物、放疗等外界刺激时免受凋亡；促进凋亡相关基因主要有Bax、Bad、Bid等[12-13]。有研究表明，miR-3175在胶质瘤中表达水平明显升高，转染miR-3175抑制物后胶质瘤细胞增殖和侵袭能力得到有效抑制，miR-3175表达下降可导致凋亡相关蛋白Bcl-2、细胞色素C、Caspase-3的异常表达[14]。此外，多种化疗药物、中药活性成分均能通过调控Bcl-2、Mcl-1和bax基因蛋白表达水平而抑制神经胶质细胞增殖及促进其凋亡[15-16]。因此，miR-127-3p能抑制神经胶质U251细胞的增殖，并促进U251细胞凋亡，其机制可能与调控凋亡相关Bcl-2家族基因有关。

miRNA主要通过与靶基因mRNA 3'UTR区域结合而调控靶基因表达，进而调控靶基因在转录后的水平，从而广泛参与多种恶性肿瘤生物学功能的调控过程[3]。miRNA可能有多个靶基因，多个miRNA也可能调控同1个靶基因。为阐明miR-127-3p调控的靶基因，本研究采用在线靶基因预测软件预测得到miR-127-3p的可能靶基因是MAPK4，并且通过双荧光素酶报告试验证实miR-127-3p mimic能与MAPK4 mRNA的3'UTR区域结合，这提示miR-127-3p能直接作用于靶基因MAPK4。Zhang等[17]人研究表明，miR-127能介导靶基因IL-6基因调控口腔天疱疮的发生发展。然而，miR-127-3p与靶基因MAPK4结合后是否能发挥功能作用需要得到进一步探讨。本研究采用模拟物上调U251细胞的miR-127-3p表达水平，结果发现MAPK4 的蛋白表达水平被抑制，这提示miR-127-3p可能通过直接结合MAPK4而抑制其表达水平。

MAPK4属于丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)家族成员之一，参与调控多种细胞的增殖和分化[18]。MAPK在多种恶性肿瘤中存在异常活化，张静等[19]人通过免疫组化分析显示，MAPK及p-MAPK在人胶质瘤组织中阳性表达区域面积百分率均高于正常脑组织，提示MAPK及其异常活化与神经胶质瘤的发生发展有关。此外，麦秀英等[20]人采用生物信息学分析表明，胰岛素样生长因子受体Ⅰ的3'UTR有多种miRNAs的结合位点，并参与信号通路中MAPK及PI3K/AKT的调节，从而调控胶质瘤的形成和发展。那么，结合本研究miR-127-3p靶向调控MAPK4的结果，本研究推测miR-127-3p通过下调靶基因MAPK4而抑制神经胶质瘤U251细胞增殖，但miR-127-3p介导靶基因MAPK4调控神经胶质瘤细胞生物学功能的作用仍有待进一步深入研究。

总之，本研究结果表明miR-127-3p在神经胶质瘤患者的脑脊液中呈低表达，上调miR-127-3p能抑制神经胶质瘤U251细胞增殖，促进其凋亡，其机制可能与调控Bcl凋亡相关基因及抑制靶基因MAPK4有关。