溶栓前A2b受体水平与脑缺血出血转化的关系研究

雷明

缺血性脑卒中(ischemic stroke)是一种致死率和致残率均较高的脑血管疾病，产生的原因主要是因脑血管发生闭塞导致脑组织缺血性损伤，发生急性脑卒中时应尽早开通阻塞血管、挽救缺血半暗带，恢复脑组织血流供应，减轻因缺血造成的神经功能损害[1]。目前国内外公认的发病4.5 h内使用重组组织型纤溶酶原激活剂(recombinant tissue plasminogen activator, rtPA)进行静脉溶栓治疗能有效降低致残率，但是出血转化是静脉rtPA溶栓治疗后最常见且最严重的并发症，部分患者会出现严重致残甚至死亡，严重影响溶栓治疗的安全性和临床疗效，导致临床溶栓治疗率不足5%，严重制约了静脉溶栓治疗的临床应用[2-3]。因此，寻找有效预测脑缺血溶栓治疗后出血转化的指标对提高静脉溶栓治疗的安全性和有效性具有重要的临床价值。有研究显示腺苷受体在脑缺血中具有重要生物效应[4]，本研究旨在探讨腺苷A2b受体对脑缺血溶栓治疗后出血转化的预测价值，为临床提高静脉溶栓治疗的安全性和有效性提供参考依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象

所有入选对象为2015年1月-2017年3月就诊于本院的缺血性脑卒中患者83例，其中男53例，女30例，年龄63～75岁，平均年龄(65.2±6.3)岁，所有入选患者在其家属签订书面知情同意的基础上经医院伦理委员会批准后开展本研究。入院开始治疗前按照美国国立卫生研究院卒中量表(National Institute of Health Stroke Scale, NIHSS)进行神经功能评价。入选标准：所有病例符合中国急性缺血性脑血管疾病诊断标准2010版，发病在3 h以内，经头颅CT和MRI确认存在血管闭塞或狭窄同时排除颅内出血，存在脑功能受损的体征超过1 h，且均经溶栓治疗。排除标准：年龄<18岁者，既往有颅内出血史、脑梗死史、心肌梗死史，近半年内有头颅外伤史，患有肝肾等重要内脏恶性肿瘤者，妊娠期女性，入院24 h内死亡者，不能耐受静脉rtPA溶栓治疗者。

1.2 腺苷A2b受体mRNA水平的检测

采用RT-PCR法进行腺苷A2b受体mRNA表达水平的检测，抽取患者静脉血6 mL，经肝素抗凝后用Ficoll-Hypague淋巴细胞分离液获取单个核细胞，然后加RPMI-1640培养液于室温下培养15 h(5%CO2)，利用Trizol试剂提取总RNA后取1 μg，添加dT15(0.5 μg)、dNTPs(1mmol/L)、rRNasin(20U)、M-MLV逆转录酶(200U)至总体积25 μl，40 ℃进行1 h，然后92 ℃进行10 min。按上游5’-TTCTACGGCTGCCTCTTCCTCG-3’，下游5’-GCACTGTCTTTACTGTTCCACC-3’;上游5’-TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCACC-3’，下游5’-CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA-3’分别合成腺苷A2b受体和内参照GAPDH的引物，分别作227 bp、598 bp片段扩增。PCR循环条件为92 ℃变性2 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，32次循环后取10 μL产物进行电泳(1.8%琼脂糖凝胶)，利用显微成像系统进行密度扫描计算相对比值。

1.3 溶栓治疗

根据《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2014》[5]的要求，所有患者在起病4.5 h内静脉给予rtPA(商品名为爱通立，德国勃林格英格翰公司生产)进行溶栓治疗，规格为20 mg/支，干粉制剂，按体质量的0.9 mg/kg给药，最大剂量为90 mg，最初1 min内静脉推注10%的剂量，剩余剂量持续静脉微泵注入1 h。

1.4 出血转化的评价及分组

患者经溶栓治疗后24 h内进行头颅CT和MRI复查，与治疗前相比新发现有高密度(CT)、低信号(MRI)病灶，则认为是发生出血转化，并分为HT组和非HT组。

1.5 统计学处理

采用SPSS17.0统计软件，计数资料组间比较使用χ2检验，计量资料组间比较使用t检验，以P<0.05示差异具有统计学意义。采用多因素非条件Logistic回归分析急性脑缺血患者经静脉溶栓治疗后发生HT的独立危险因素。

2 结 果

2.1 出血转化组与非出血转化组患者一般临床资料比较

经静脉溶栓治疗后发生HT者有36例，占43.4%。比较HT组和非HT组患者入院时的临床资料显示，2组患者在年龄、性别比例、吸烟史、TC、HDL-C、NIHSS评分均无统计学差异(P>0.05)，但2组患者在高血压病、糖尿病方面存在明显差异，HT组高于非HT组(P<0.05)(表1)。

表1 HT组与非HT组患者一般临床资料比较

2.2 ROC曲线分析腺苷A2b受体在脑缺血溶栓治疗后发生HT的预测价值

以是否发生HT为状态变量，作腺苷A2b受体mRNA表达的ROC曲线，分析预测脑缺血患者经静脉溶栓治疗后发生HT的预测值为0.63，此时AUC=0.716，95%CI=0.628～0.837，P<0.001，敏感度71.3%，特异度为80.4%(图1)。

图1 腺苷A2b受体对溶栓后发生HT的诊断价值

2.3 logistic回归分析经溶栓治疗后发生HT的危险因素

将有统计学意义的变量进行多因素非条件logistic回归分析显示，腺苷A2b受体和高血压病是经溶栓治疗后发生HT的危险因素，而糖尿病不是经溶栓治疗后发生HT的危险因素。

表2 logistic回归分析经溶栓治疗后发生HT的危险因素

2.4 经溶栓治疗后HT组与非HT组NIHSS评分比较

在经溶栓治疗后HT组与非HT组中每组再分为腺苷A2b受体>0.63组和腺苷A2b受体<0.63组，HT组NIHSS评分高于非HT组，同时HT组中腺苷A2b受体>0.63组的NIHSS评分最高，非HT组中腺苷A2b受体<0.63组的NIHSS评分最低。

表3 经溶栓治疗后HT组与非HT组NIHSS评分比较，分)

3 讨 论

腺苷是一种重要的神经递质，当脑组织受损时其局部浓度增大与相应的受体结合，腺苷受体为G蛋白偶联受体家族[6]。有研究显示腺苷受体在脑缺血过程中具有神经保护作用，而腺苷A2b受体是与腺苷亲和力最低的1个受体[7-8]。动物实验研究显示发生脑缺血时腺苷A2b受体被激活，其蛋白表达水平上调，cAMP释放增加，从而加速糖原分解，增大神经元的能量供应，起到神经保护的作用[9]。当患者发生脑卒中局部脑组织缺血缺氧时主要分布在海马的腺苷A2b受体则被激活，可能参与抑制兴奋性神经递质释放，从而产生神经保护作用有关[10]。

本研究结果显示，HT组患者外周血单个核细胞腺苷A2b受体mRNA的表达水平明显高于非HT组，利用ROC曲线分析腺苷A2b受体mRNA表达对预测脑缺血患者经静脉溶栓治疗后发生HT具有一定的预测价值(AUC=0.716，95%CI=0.628～0.837，P<0.001，敏感度为71.3%，特异度为80.4%)，诊断临界值为0.63，说明当患者外周血单个核细胞腺苷A2b受体mRNA的表达水平高于0.63时，应注意密切关注患者头颅CT和MRI检查，必要时进行动态观察甚至再手术，及时调整治疗药物，降低患者发生HT的风险，以期提高患者治疗的疗效。经多因素非条件Logistic回归分析显示，腺苷A2b受体表达水平是脑缺血患者经溶栓治疗后发生HT的独立危险因素(OR=0.916，95%CI=0.899～0.969，P=0.032)，高血压病也是经溶栓治疗后发生HT的危险因素，但糖尿病不是经溶栓治疗后发生HT的危险因素。经过溶栓治疗后评价各组的NIHSS评分显示，HT组中腺苷A2b受体>0.63组的NIHSS评分最高，非HT组中腺苷A2b受体<0.63组的NIHSS评分最低。

本研究过程中存在一定的局限性，首先患者经溶栓治疗后24 h内进行头颅CT和MRI复查判断有无HT的发生，而CT和MRI的检查仍然有可能会存在一定的漏诊情况，不能确保100%准确率，在后期的进一步研究过程中可选择不同的时间点进行动态观察，以期提高复查诊断发生HT的准确率；其次，由于缺血性脑卒中患者发生尿路感染和吸入性肺炎的可能性较大，而本研究仅检测患者外周血单个核细胞腺苷A2b受体mRNA的表达水平，尚未排除因感染因素造成溶栓治疗后发生HT的影响，因此进一步的研究可考虑将超敏C反应蛋白纳入检测指标以排除感染因素的影响[11]。另外，本研究没有对患者经治疗后外周血腺苷A2b受体mRNA的表达水平进行重复检测，虽然目前尚无因感染因素导致患者腺苷A2b受体表达水平发生变化，但是患者的病情严重程度可能会影响腺苷A2b受体的表达水平；最后，由于本研究样本均来源单中心，样本量小，未来更深入的研究需要进一步扩大样本量，选取多中心样本进行前瞻性的研究。

综合以上分析，本研究结果提示腺苷A2b受体表达水平是急性脑缺血患者溶栓治疗后发生HT的独立危险因素，检测其水平对预测脑缺血患者溶栓治疗后发生HT具有预测价值。