CD20单核苷酸多态性对利妥昔单抗治疗急性淋巴细胞白血病的影响

刘卉 刘宇宏

1西安医学院第一附属医院血液科（西安 710071）；2延安大学附属医院免疫血液科（陕西延安 716000）

利妥昔单抗是一种由小鼠抗体可变区序列和人源化抗体恒定区及Fc区序列组成的人鼠嵌合性抗CD20单克隆抗体［1］。利妥昔单抗通过与细胞表面上的CD20结合诱发的补体依赖性细胞毒作用和抗体依赖性细胞毒作用以及细胞凋亡作用来杀伤癌细胞［1-2］。利妥昔单抗已经作为治疗急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）的重要手段之一。笔者通过临床研究发现，ALL患者在临床治疗中对利妥昔单抗表现出一定的拮抗性，但是这种拮抗的分子机制尚未明确。大多数ALL患者白血病细胞仅表达淋巴细胞抗原，其中30%～40%前B细胞和80%～90%成熟B细胞表达CD20抗原［3］。CD20在ALL细胞的高表达为抗CD20单克隆抗体利妥昔靶向治疗ALL提供了理论基础［4］。但是关于CD20单核苷酸多态性与抗CD20的利妥昔单抗治疗ALL之间的关系尚不明确，因此本研究报道了CD20编码的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）rs2070770与急性淋巴细胞白血病对利妥昔单抗的响应之间的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2012年1月至2017年2月确诊为ALL的患者308例。患者年龄0～30岁；男162例，女146例。患者随机分为两组，对照组（n=154）：患者接受5个疗程常规化疗；试验组（n=154）患者在接受常规化疗的同时联合利妥昔单抗治疗，每周剂量为375 mg/m2，连续使用4周。排除父母与子代均参与本研究。本研究通过医院道德伦理委员会批准。患者签署知情同意书。

风险组划分：低危组包括超二倍体（51～65条染色体）、t（12；21）（p13；q22）和（或）ETV6⁃RUNX1；高危组包括亚二倍体（＜44条染色体）、t（v；11q23）、t（9；22）（q34；q11.2）和复杂染色体异常。在人口统计学和不同的疾病特征间基因型频率差异无统计学意义。

1.2 CD20 SNP基因分型CD20编码的SNP rs2070770⁃Ala14Val基因分型通过 TaqMan SNP 基因分型技术检测，并随机选取每种基因型的PCR产物进行基因测序，验证结果。基因型频率符合Hardy⁃Weinberg平衡。

1.3 细胞表面CD20的表达水平使用流式细胞仪测量骨髓细胞平均荧光强度检测CD20表达量。骨髓细胞与CD20⁃FITC在黑暗中孵育20 min，然后加入pH 7.2 NH4Cl裂解5 min，PBS清洗，1%多聚甲醛固定，流式细胞仪收集细胞，记录数据。

1.4 统计学方法计量资料结果以s的形式表示，使用SPSS 18.0软件进行统计分析。数据满足正态分布及方差齐性，两组资料的比较采用配对t检验；两样本率之间的比较采用χ2检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 rs2070770基因型频率308例患者rs2070770基因分型：CC基因型157例（51.0%），CT基因型116例（37.7%），TT基因型35例（11.4%），等位基因T频率为30.2%。对照组与试验组间基因型频率比较差异无统计学意义（P＞0.05），低危组与高危组间基因型频率比较差异也无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 受试者CD20 rs2070770基因型频率Tab.1 CD20 rs77878271 genotype frequencies of subjects

2.2 rs2070770基因型与白血病细胞表面CD20强度有关对照组、试验组、低危组和高危组的纯合子CC基因型患者的癌细胞CD20表达高于杂合子CT和纯合子TT，杂合子CT患者的癌细胞CD20表达高于纯合子TT患者。rs2070770等位基因T与细胞表面低CD20表达显著相关（表2）。

表2 rs2070770基因型与淋巴细胞表面CD20表达Tab.2 rs2070770 genotype and cell surface CD20 expression in leukemic cells ± s

表2 rs2070770基因型与淋巴细胞表面CD20表达Tab.2 rs2070770 genotype and cell surface CD20 expression in leukemic cells ± s

组别对照组试验组低危组高危组例数154 154 206 102 CC（n=157）CT（n=116）TT（n=35）n 76 81 137 20 CD20 262.1±12.3 178.7±9.1 121.6±9.0 228.2±15.7 n 59 57 101 15 CD20 126.7±10.2 158.7±10.8 88.3±6.3 183.1±8.6 n 18 17 30 5 CD20 34.5±4.6 55.8±4.9 38.9±3.8 50.5±4.5 χ2值7.82 7.29 8.56 6.43 P值＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01

2.3 rs2070770基因型决定了急性淋巴细胞白血病临床应答rs2070770 SNP基因型与临床终点OS（总生存期）、DFS（无病生存期）、RR（相对危险度）和TRM（病死率）有关。对照组rs2070770纯合子CC基因型患者的RR为48.3%，试验组rs2070770纯合子CC基因型患者的RR为25.6%（P＜0.01）。两组患者的DFS分别为45.5%和63.7%（P＜0.01）（表3）。相反的，利妥昔单抗治疗后杂合子CT和纯合子TT基因型患者RR与无利妥昔单抗治疗组的RR无差异。不同基因型的患者5年OS和TRM差异没有统计学意义，CT和TT基因型患者的疗效相似。

表3 rs2070770 SNP基因型与患者的临床终点Tab.3 Genetype of rs2070770 SNPand clinical outcome ± s

表3 rs2070770 SNP基因型与患者的临床终点Tab.3 Genetype of rs2070770 SNPand clinical outcome ± s

临床结局例数5年OS（%）DFS（%）RR（%）TRM（%）CC（n=157）CT（n=116）TT（n=35）对照组76 57.9±7.2 45.5±9.4 48.3±9.2 4.3±1试验组81 64.2±7.1 63.7±7.3 25.6±7.2 8.2±5.5 P（χ2）值P（χ2）值P（χ2）值0.16（1.11）＜0.01（6.74）＜0.01（7.32）0.14（1.16）对照组59 67.2±7.6 62.2±9.5 38.2±9.3 3.3±3.5试验组57 63.2±8.1 55.2±9.5 36.8±9.1 5.5±4.2 0.66（0.19）0.82（0.07）0.96（0.05）0.50（0.31）对照组19 68.9±10.2 54.7±10.6 45.6±10.8-试验组16 66.9±12.4 51.5±12.5 43.6±10.8 1±2.2 0.82（0.07）0.98（0.05）0.86（0.06）0.29（0.82）

2.4 不同危险组rs2070770基因型患者利妥昔单抗治疗的临床疗效在低危组，利妥昔单抗治疗后CC基因型患者RR为10.5%，无利妥昔单抗治疗组CC基因型患者RR为36.7%（P＜0.01）。相反的，利妥昔单抗治疗后杂合子CT和纯合子TT基因型患者RR与无利妥昔单抗治疗组的RR无差异（表4）。在高危组，利妥昔单抗治疗后CC基因型患者RR为35.6%，无利妥昔单抗治疗组CC基因型患者RR为71.0%（P=0.07）（表5）。不同险组内，不同基因型的患者5年OS和TRM没有统计学差异。通过比较可知，利妥昔单抗对rs2070770 CC基因型患者响应较好，而且在低危组的疗效高于高危组。

表4 低危组rs2070770 SNP基因型与患者的临床终点Tab.4 Genetype of rs2070770 SNPand clinical outcome in low risk group ± s

表4 低危组rs2070770 SNP基因型与患者的临床终点Tab.4 Genetype of rs2070770 SNPand clinical outcome in low risk group ± s

临床结局例数5年OS（%）DFS（%）RR（%）TRM（%）CC（n=137）CT（n=101）TT（n=30）对照组65 72.1±11.5 55.7±13.2 36.7±13.1 6.2±6.0试验组72 90.3±7.5 84.4±9.2 10.5±8.2 6.2±6.5 P（χ2）值P（χ2）值P（χ2）值0.02（3.28）＜0.01（7.56）＜0.01（6.88）0.94（0.06）对照组57 87.8±8.2 72.2±13.5 25.6±13.1 2.0±4.0试验组44 74.4±12.2 70.5±14.1 19.3±11.2 11.5±10.5 0.06（2.78）0.79（0.09）0.48（0.52）0.11（1.56）对照组15 85.3±17.2 61.5±18.2 39.5±18.3 0试验组15 80.3±22.8 54.5±30.5 42.5±30.2 0 0.76（0.09）0.68（0.18）0.68（0.17）1.00（＜0.01）

表5 高危组rs2070770 SNP基因型与患者的临床终点Tab.5 Genetype of rs2070770 SNPand clinical outcome in high risk group ± s

表5 高危组rs2070770 SNP基因型与患者的临床终点Tab.5 Genetype of rs2070770 SNPand clinical outcome in high risk group ± s

临床结局例数5年OS（%）DFS（%）RR（%）TRM（%）CC（n=20）CT（n=15）TT（n=5）对照组9 45.6±12.3 30.8±12.9 71.0±23.2 0±0试验组11 41.3±19.5 43.5±20.6 35.6±27.1 21.5±23.5 P（χ2）值P（χ2）值 试验组P（χ2）值0.77（0.09）0.50（0.31）0.07（2.12）0.13（1.18）对照组7 32.5±12.5 28.5±12.6 65.7±13.7 7.5±14.2试验组8 60.2±12.1 56.8±12.5 44.5±12.6 0±0 0.06（2.15）0.11（1.21）0.26（0.85）0.27（0.98）对照组2 15.2±10.4-25.8±20.2 0±0 3--30.8±21.4 25.5±20.5 0.64（0.19）0.62（0.22）0.92（0.07）0.33（0.72）

3 讨论

美国国家综合癌症网络（NCCN）最新发布的临床实践指南指出可以考虑使用靶向作用于特定异常的新型免疫制剂，针对CD20表达B细胞谱系ALL的抗CD20单克隆抗体利妥昔单抗。最近有研究显示，利妥昔单抗单药治疗CD20+急性淋巴细胞白血病具有一定的疗效，在标准化疗中加入利妥昔单抗效果更加显著，可有效提高低中度风险患者的生存率［5-6］。对于青少年急性淋巴细胞白血病，本研究结果表明标准化疗联合利妥昔单抗可以有效改善患者的临床结局，患者癌细胞CD20出现变异会降低利妥昔单抗对急性淋巴细胞白血病的治疗疗效。ALL的处理方案很大程度上与患者的年龄有关，15～39岁的患者可考虑采用治疗儿童的强化疗法，年龄≥40岁的成年人很难耐受大剂量的儿童强化疗法，因此本研究的患者纳入年龄范围为0～30岁。

有研究报道CD20 rs2070770基因多态性的编码、调控及细胞表面CD20表达与临床结局有关［7-9］。本研究结果与前人研究保持一致，SNP rs2070770可以预测利妥昔单抗对急性淋巴细胞白血病的应答，而且rs2070770基因型与白血病细胞表面CD20表达显著相关。有研究报道利妥昔单抗的疗效受限于CD20的高表达［10-11］和细胞较好的遗传性［12-13］。因此本研究评价了不同危险组CD20基因型对利妥昔单抗疗效的影响。利妥昔单抗联合化疗与单独化疗组相比，低危组和高危组CC基因型患者的RR几乎下降了50%左右，DFS也出现一定程度的升高；当患者出现T等位基因的时候，两组患者的RR和DFS几乎没有变化。低危组与高危组对比后发现，利妥昔单抗对rs2070770 CC基因型患者响应较好，而且在低危组的疗效高于高危组。

综上所述，rs2070770位点CC基因型患者在接受利妥昔单抗治疗时效果较好，它是预测患者是否适于利妥昔单抗治疗的一种潜在生物标志物。而且对于不同危险程度的患者来说，低危险患者对利妥昔单抗的响应更好。