miR⁃34a对人结肠癌SW480细胞增殖、凋亡、细胞周期及皮下移植瘤生长的影响

王传卓 辛鹤 刘波 刘兆玉

中国医科大学附属盛京医院介入科（沈阳 110004）

结直肠癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，全世界每年约1 360 000新发患者［1］，发病率和病死率成逐年上升趋势。结直肠癌治疗以手术切除及化疗为主，临床治疗策略逐步改善，但5年生存率仍不理想，因此，寻找新的诊疗靶点及策略显得尤为重要［2］。

microRNA是一类内源性、短链、非编码RNA，在转录后水平调控基因表达，参与众多生理及病理过程［3］。大量研究［4］表明，几乎在所有肿瘤都存在miRNA表达异常，miRNA在肿瘤发生及发展的多个环节发挥重要作用。miRNA在结肠癌中的角色越来越受到关注，miR⁃34a也是其中一员，之前的研究已经证实miR⁃34a可抑制结肠癌的生长和转移［5-6］，但同时在细胞和动物实验中验证目前国内外少有研究。本研究通过慢病毒转染技术，在人结肠癌SW480细胞系中过表达miR⁃34a，研究miR⁃34a对人结肠癌细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响；并通过构建裸小鼠皮下移植瘤模型，绘制肿瘤生长曲线，研究miR⁃34a对结肠癌细胞皮下移植瘤生长的影响，通过细胞实验联合动物实验的方法揭示miR⁃34a对结肠癌生长的影响，为结肠癌的诊疗提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 实验动物及伦理本实验研究已通过中国医科大学附属盛京医院医学伦理委员会审核。4～6周龄Balb/c⁃nu裸小鼠20只，雌雄各半，体质量16～20 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，于SPF环境下饲养。

1.2 细胞培养、转染及实验分组人结肠癌SW480细胞（中国科学院上海生命科学院细胞库）用含10%胎牛血清（Gibco公司）的RPMI1640培养液（Gibco公司）、于37℃、5%CO2培养箱中培养。过表达miR⁃34a慢病毒和对照组空载慢病毒由上海吉凯基因化学技术有限公司包装合成，目的基因慢病毒载体 GV309，引物序列：5′⁃GGAAAGGAC⁃GAAACACCGGATCCTTTCTTTCCTCCCCAC⁃3′［has⁃mir⁃34a（4174⁃1）⁃P1］，5′⁃TGTCTCGAGGTCGAGA⁃ATTAAAAAACGCAGAAGAGCTTCC⁃3′［has⁃mir⁃34a（4174⁃1）⁃P2］；对照组插入序列5′⁃TTCTCCGAAC⁃GTGTCACGT⁃3′。实验分两组：miR⁃34a组（转染过表达miR⁃34a的慢病毒载体）和NC组（阴性对照组，转染空病毒载体）。将SW480细胞以1×105/孔的细胞数接种于6孔板，细胞融合度达20～30%时，以MOI值=20感染SW480细胞，感染72 h后，细胞GFP绿色荧光率达85%以上，收集细胞进行实验。

1.3 Quantitativereal⁃timePCR（qRT⁃PCR）检测按照TRIzol Regent试剂（Ambion公司）说明书方法提取细胞及移植瘤组织中的总RNA。使用Takara 公司 的 Mir⁃X miRNA First⁃Strand Synthesis Kit进行miRNA的反转录反应合成cDNA，SYBR Advantage qPCR Premix进行qRT⁃PCR检测，以U6为内参。LightCycler480进行PCR扩增，反应条件如下：模板预变性95℃、20 s；PCR反应95℃、5 s，60 ℃、20 s，共40个循环，以2⁃ΔΔCt法计算 miRNA的相对表达量。引物由上海生工生物工程公司合成，miR⁃34a上游引物：5′⁃GGCAGTGTCTTAGCT GGTTG⁃3′，下游引物试剂盒内提供；U6上游引物：5′⁃GGAACGATACAGAGAAGATTAGC⁃3′，下游引物：5′⁃TGGAACGCTTCACGAATTTGCG⁃3′。

1.4 细胞增殖实验按照北京碧云天公司的CCK⁃8细胞增殖检测试剂盒说明书步骤操作。收集细胞、调整细胞悬液浓度5×104/mL，于96孔板中接种细胞悬液100μL/孔，37℃连续培养4 d，每天更换培养液。每孔加入10μL CCK⁃8试剂，培养箱内孵育2 h后，酶标仪测定在450 nm处各孔的吸光值，绘制细胞增殖曲线。

1.5 细胞凋亡检测按照eBioscience公司的An⁃nexin V⁃APC单染法细胞凋亡检测试剂盒说明书步骤操作。消化、离心、洗涤细胞。200μL 1×binding buffer重悬细胞沉淀，加入10μL Annexin V⁃APC染色，室温避光15 min，再加入400 μL 1×binding buf⁃fer，1 h内上流式细胞仪检测。

1.6 细胞周期检测按照凯基生物公司的细胞周期检测试剂盒说明书步骤操作。收集细胞、调整浓度为1×106/mL，取1 mL单细胞悬液、离心、去上清，加入500μL体积分数为70%的乙醇固定过夜。PBS洗去固定液，加入100μL的RNase A，37℃水浴30 min，再加入400μL的PI染色混匀，4℃避光30 min，流式细胞仪进行检测，记录激发波长488 nm处红色荧光。

1.7 裸鼠皮下移植瘤模型构建及瘤体测量收集细胞，调整浓度为1×107/mL，1 h内使用。于裸鼠右后肢腹侧皮下注射0.2 mL肿瘤细胞悬液，依据注射细胞不同，分为两组：鼠⁃miR⁃34a组和鼠⁃NC组，每组10只，雌雄各半。术后继续在SPF条件下饲养，正常饮食，观察裸鼠皮下成瘤情况，每7天使用游标卡尺测量裸鼠皮下移植瘤长径（L）及短径（W），利用公式V=（L×W2）/2计算体积，绘制移植瘤生长曲线。第28天颈椎脱位法处死裸鼠，完整取出皮下移植瘤，电子天平称重。组织标本于离体30 min内保存，一半置于液氮中冻存，一半置于4%多聚甲醛溶液中固定。

1.8 统计学分析采用SPSS 16.0软件分析数据，计量资料以均值±标准差表示，组间比较采用独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR⁃34a在各组SW480细胞中的相对表达通过慢病毒介导转染方法，获得了稳定高表达miR⁃34a的SW480细胞株（图1）。qRT⁃PCR检测两组细胞中miR⁃34a相对表达量的结果显示：miR⁃34a组高于NC组（图2a，t=-54.190，P＜0.05）。

图1 慢病毒转染后的SW480细胞及绿色荧光表达（左侧为白光视野，右侧为对应荧光视野，×200）Fig.1 SW480 cells transfected with lentivirus were observed with white bright（left）and green fluorescence assay（right）in the same vision using fluorescence microscopy（× 200）

图2a qRT⁃PCR检测两组细胞中miR⁃34a的相对表达量Fig.2a The relative expression of miR⁃34a was detected by qRT⁃PCRin cells

图2b qRT⁃PCR检测两组皮下移植瘤中miR⁃34a的相对表达量Fig.2b The relative expression of miR⁃34a was detected by qRT⁃PCRin xenograft tumors

2.2 miR⁃34a对SW480细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响CCK⁃8法检测各组细胞增殖情况的结果显示（图3）：随着培养时间的延长，miR⁃34a组细胞增殖能力逐渐低于NC组，培养至第2天时，差异有统计学意义（t=18.832，P＜0.05）。流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况的结果显示（图4）：miR⁃34a组的凋亡率（10.44±0.29）%明显高于NC组（3.93±0.06）%，差异有统计学意义（t=-65.026，P＜0.05）。流式细胞仪检测各组细胞周期的结果显示（图5）：miR⁃34a组细胞G0/G1期为（48.81±0.64）%，低于NC组（52.48±0.64）%，差异有统计学意义（t=12.125，P＜0.05）；miR⁃34a组细胞S期为（16.51±0.36）%，低于NC组（21.39±0.38）%，差异有统计学意义（t=28.035，P＜0.05）；miR⁃34a组细胞G2/M期分别为（34.68±0.67）%，高于NC组（26.02±0.42）%，差异有统计学意义（t=-32.989，P＜0.05）。上述实验结果表明：miR⁃34a可抑制人结肠癌SW480细胞增殖、促进凋亡，诱导细胞周期出现G2/M期阻滞。

图3 CCK⁃8检测miR⁃34a对结肠癌SW480增殖能力的影响Fig.3 CCK⁃8 method to detect the effect of miR⁃34a on SW480 cells proliferation

图4 单染法、流式细胞仪检测细胞凋亡结果：右上象限与右下象限之和代表凋亡细胞所占百分比，miR⁃34a组的凋亡率高于NC组Fig.4 Single staining and flow cytometry were used to detect apoptosis：the sum of right upper and right lower quadrant represents the percentage of apoptotic cells and the apoptotic rate of miR⁃34a group was higher than that of NCgroup

2.3 miR⁃34a对裸鼠皮下移植瘤生长的影响皮下移植瘤生长曲线结果显示（图6），鼠⁃miR⁃34a组肿瘤生长速度慢于鼠⁃NC组，在接种细胞14 d后差异有统计学意义（t=3.029，P＜0.05）。鼠⁃miR⁃34a组移植瘤最终体积和重量分别为（207.59±34.49）mm3和（199.64±35.28）mg，均低于鼠⁃NC组（272.53±31.72）mm3和（260.72 ± 43.09）mg（t=4.383，P＜0.05和t=3.469，P＜0.05）。qRT⁃PCR检测两组移植瘤中miR⁃34a相对表达量的结果显示：鼠⁃miR⁃34a组高于鼠⁃NC组（图2b，t=-55.474，P＜0.05）。上述结果表明：miR⁃34a可抑制裸鼠皮下移植瘤生长。

图5 流式细胞仪检测细胞周期结果：miR⁃34a组的第二峰（G2/M期）高于NC组Fig.5 Flow cytometry results in cell cycle：the second peak in the miR⁃34a group（G2/M phase）was higher than the NC group

图6 裸鼠皮下移植瘤生长曲线Fig.6 Growth cruve of subcutaneously xenograft tumors

3 讨论

miRNA是一类普遍存在于真核生物中、高度保守的非编码RNA分子，由18～25个核苷酸组成，可通过与下游靶基因mRNA的3′UTR区序列互补结合，引起靶基因降解或抑制翻译［7-8］。人miR⁃34a定位于染色体1q36.22，是一段比较脆弱的区域，在宫颈癌、乳腺癌、食管癌、胃癌、肝癌、结肠癌等多种恶性肿瘤组织中发现miR⁃34a表达下降，其表达水平与恶性肿瘤的临床分期、肿瘤复发相关［9-11］。研究表明［12］，miR⁃34a与经典抑癌基因p53关系密切，p53可使miR⁃34a的CpG岛启动子区域去甲基化，诱导miR⁃34a表达，进而调控miR⁃34a下游靶基因。但p53对miR⁃34a功能并非必须，在缺乏内源性p53的情况下，miR⁃34a仍能抑制肿瘤细胞的生长。

肿瘤细胞的增殖能力是影响肿瘤进展的重要因素，且与细胞凋亡和细胞周期密切相关。研究［13-14］报道，miR⁃34a可靶向调节 PDGFRA、PAR2等基因，进而抑制结肠癌细胞增殖。本研究通过CCK⁃8法测定miR⁃34a组细胞增殖能力低于NC组，培养至第72、96 h时的差异有统计学意义（P＜0.05），证实了miR⁃34a可抑制人结肠癌SW480细胞增殖。凋亡是细胞程序性死亡过程，异常凋亡可导致多种疾病发生。细胞的凋亡受细胞凋亡基因严格调控，miR⁃34a对凋亡影响主要通过p53相关通路实现，参与p53下游的调控通路，抑制抗凋亡基因Bcl⁃2的表达，凋亡细胞比例增多，可有效抑制细胞增殖速率［15］，Bcl⁃2信号通路在细胞增殖与凋亡过程中发挥重要作用。本研究中miR⁃34a组的凋亡率明显高于对照组，表明miR⁃34a可诱导人结肠癌SW480细胞凋亡，从而抑制其增殖速率，在结肠癌的发生、发展中发挥“抑癌基因”作用。恶性肿瘤最基本的生物学特征之一是细胞周期调控紊乱导致的细胞恶性转化和肿瘤细胞失控性增殖，细胞周期依赖激酶（CDKs）和细胞周期蛋白（Cyclin）在G1期向S期过渡及G2期向M期过渡过程中发挥重要作用［15］。本研究通过外源性过表达miR⁃34a，使人结肠癌SW480细胞G2/M期明显高于对照组，说明过表达miR⁃34a可以诱导细胞周期出现G2/M期停滞，达到抑制细胞增殖、促进衰老作用。上述实验结果证实了，在体外条件下过表达miR⁃34a可抑制结肠癌SW480细胞增殖，增殖能力的降低可能通过诱导凋亡和细胞周期阻滞得以实现。miRNA可以通过多条信号通路影响下游靶基因，进而改变细胞的生物学功能。本研究不足之处是缺少miR⁃34a的作用机制研究，双荧光素酶报告基因检测是研究miRNA目的基因的经典方法，进一步检测miR⁃34a下游的目的基因、阐明其作用机制是我们下一步的研究方向。

临床实践证实，肿瘤体积是制约肿瘤根治手术的关键因素之一，高肿瘤负荷使肿瘤更易发生转移，故缩小肿瘤体积对根治肿瘤、延缓肿瘤进展具有重要意义。生物体内环境与外环境存在差异，体外实验的结果可能与动物实验存在差异，我们通过种植裸鼠皮下瘤、绘制瘤体生长曲线及称量瘤体最终重量的方法，进一步证实miR⁃34a在体内环境对结肠癌增殖的影响。实验证实，miR⁃34a可抑制肿瘤的生长速度及肿瘤的最终重量，提示miR⁃34a在裸鼠体内仍可发挥“抑癌基因”作用，抑制结肠癌细胞生长，可能成为结肠直肠癌治疗新的分子靶点。

综上所述，miR⁃34a可抑制人结肠癌SW480细胞的增殖、诱导凋亡、阻滞细胞周期，动物实验进一步证实miR⁃34a可抑制裸鼠皮下移植瘤生长，miR⁃34a可能为结直肠癌的诊疗提供新的依据和分子靶点。