超声介导载miR⁃34a脂质微泡对宫颈癌抑制作用的体内实验研究

马瑶 刘朝奇 郑智唯 姜矜君 赵云

1三峡大学医学院（湖北宜昌 443002）；2肿瘤微环境与免疫治疗湖北省重点实验室（湖北宜昌 443002）

MicroRNA（miRNA）是一类非编码小分子RNA，在肿瘤的早期诊断、病情监测、预后评估等方面已获得许多成果［1］，WANG等［2］研究发现感染HPV16的宫颈癌中miR⁃34a低表达，提示miR⁃34a在肿瘤中可能有抑癌因子样作用，有望成为宫颈癌基因治疗的靶点。近年来，随着超声微泡造影技术的发展，不仅将微泡造影剂用于成像，还可以作为基因或药物的载体，在超声辐照下，达到定位释放、靶向治疗的目的［3］。基于以上研究成果，本实验着重探讨了超声介导载miR⁃34a脂质微泡对小鼠U14皮下移植瘤的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器二硬脂酰磷脂酰胆碱（DSPC）、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（DSPE⁃PEG 2000）、聚醚酰亚胺（PEI⁃600）、全氟丙烷气体（C3F8）、氮气、超声波清洗仪（SONICS）、涡旋器、扫描电镜（JSM⁃7500F）、马尔激光粒度仪（Nano⁃ZS90型）、超声治疗仪（UGT1025）、血球计数板、微量核酸蛋白检测仪（Thermo scientific）、组织研磨器（TIANGEN⁃OSEY50）、实时荧光定量 PCR 仪（Applied Biosystems，Step One Plus）。

1.2 载miR⁃34a阳离子脂质微泡的制备取事先配好的DSPC、DSPE⁃PEG2000、PEI⁃600混于玻璃试管中，55～60℃水浴锅预热后，涡旋状态下充入氮气使液体成膜，抽真空3 h除尽残余氯仿，加入配好的Tris缓冲液，于超声波清洗机内清洗至溶液清亮，分装至西林瓶，加盖密封，抽真空后充入C3F8置换，最后将西林瓶高频振荡即得到阳离子脂质微泡。血球计数板计数，并计算其浓度，粒度仪测量粒径，扫描电镜观察微泡形态。通过不同浓度阳离子微泡和miR⁃34a孵育后进行DNA琼脂糖凝胶电泳的实验，测试出二者最佳孵育比例，每次处理小鼠前，按每1μg质粒与107～108个的微泡的比例共同孵育miR⁃34a和阳离子脂质微泡30 min，得到载miR⁃34a阳离子脂质微泡。

1.3 实验动物及瘤株SPF级BALB/c小鼠25只，雌性，18 g左右，由三峡大学动物实验中心提供。U14宫颈癌细胞瘤株，由三峡大学肿瘤微环境与免疫治疗湖北省重点实验室提供。

1.4 小鼠U14皮下移植瘤模型建立从荷U14宫颈癌细胞的小鼠腹腔内抽取腹水，调整细胞浓度约2×107/mL于小鼠右前腋皮下接种0.2 mL，1周后形成约0.5cm皮下肿瘤结节。

1.5 动物分组及处理成功建立18只小鼠U14宫颈癌皮下移植瘤模型，随机分为3组：对照组（Control group）、空阳离子脂质微泡组（Empty cat⁃ionic lipid microbubbles group，Empty⁃CMB）、载miR⁃34a阳离子脂质微泡组（MiR⁃34a⁃loaded cationic lipid microbubbles group，MiR⁃34a⁃loaded⁃CMB），根据分组给予不同种类微泡制剂的注射，其中对照组给予相同剂量的生理盐水处理，每2天经尾静脉注射（0.2 mL/只）及超声辐照瘤体一次，辐照条件：频率1 MHz，功率1 W/cm2，占空比50%，辐照时间90s/只，并于治疗前测量瘤体长径（a）、短径（b），按公式V=1/2ab2计算肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线。治疗5次后处死小鼠，剥离瘤体，计算肿瘤体积及抑瘤率。

1.6 样本采集及相关检测将部分肿瘤组织于-80℃保存，组织研磨器（TIANGEN⁃OSEY50）研磨组织后，使用Trizol试剂（TaKaRa）按照说明书提取总RNA，使用PrimeScriptTMRT试剂盒（TaKaRa）将1～5μg RNA逆转录成cDNA，通过实时荧光定量PCR（RT⁃PCR）按 10 μL每孔的反应体系加样，包括5μL SYBR GreenⅠ（Takara），2.5μL无菌水，上下游引物各0.25μL，2μL模板cDNA，扩增反应程序为95℃预变性20 s；95℃变性3 s，60℃退火30 s，40个循环，每个样品重复3次，实验数据采用相对定量法法分析。检测肿瘤组织中miR⁃34a、c⁃met、bax表达情况。剩余组织经4%多聚甲醛固定，脱水、石蜡包埋，4μm切片，免疫组织化学法检测各组肿瘤组织中c⁃Met、Bax的蛋白表达情况。

1.7 统计学方法数据采用SPSS 18.0软件进行统计学分析，结果用均数±标准差表示，各组之间的比较使用单因素方差分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 脂质微泡形态及一般性质制备的脂质微泡为乳白色悬液，镜下呈球形（图1），分散均匀，平均粒径为（1.2±0.24）μm，平均浓度为6.4×109个/mL，调整浓度为1×109个/mL用于实验。

图1 脂质微泡形态图Fig.1 Lipid microbubbles′morphology under the microscope

2.2 阳离子脂质微泡与miR⁃34a的结合情况相同体积不同浓度阳离子微泡（CMBs）分别与等量的miR⁃34a孵育，DNA琼脂糖凝胶电泳实验结果显示，适量的CMBs与miR⁃34a结合性较好，可防止更多的DNA向正极移动（图2）。

图2 阳离子微泡的基因携载能力Fig.2 DNA⁃binding ability of cationic microbubbles

2.3 各组肿瘤生长情况对照组、空微泡组肿瘤不同程度持续增大，部分小鼠患肢出现功能障碍，治疗后载miR⁃34a阳离子脂质微泡组肿瘤生长较其他两组缓慢，各组肿瘤生长曲线（图3），各组肿瘤体积及抑瘤率（表1），载miR⁃34a阳离子脂质微泡组肿瘤平均体积明显小于其他两组。

图3 各实验组小鼠肿瘤生长曲线Fig.3 Tumor growth curves in each experimental group of mice

表1 各实验组小鼠肿瘤抑瘤率对比Tab.1 Comparison of tumor inhibition rates among mice in experimental groups± s

表1 各实验组小鼠肿瘤抑瘤率对比Tab.1 Comparison of tumor inhibition rates among mice in experimental groups± s

注：与对照组比较，*P＜0.05

组别对照组空微泡组载miR⁃34a微泡组肿瘤体积（mm3）822.11±115.95 759.37±66.67 357.89±89.59体积抑瘤率（%）0 7.63 56.47*

2.4 实时荧光定量PCR结果各组肿瘤组织miR⁃34a的表达比较：载miR⁃34a阳离子脂质微泡组的miR⁃34a表达较其他两组明显上调，差异有统计学意义（P＜0.05，图4）。各组肿瘤组织c⁃met基因及bax基因表达比较：载miR⁃34a阳离子脂质微泡组c⁃met表达较其他小组下调，bax表达上调，差异有统计学意义（P＜0.05，图4）。

图4 各实验组小鼠肿瘤组织相关基因表达量比较Fig.4 Comparison of expression levels of related gene in experimental mice

2.5 肿瘤组织免疫组织化学检测结果各组肿瘤组织c⁃Met及Bax蛋白表达比较：相对于对照组及空微泡组，载miR⁃34a阳离子脂质微泡组c⁃Met表达较低，Bax表达增高（图5）。

3 讨论

大量研究表明miRNA在肿瘤组织中表达存在差异性，因此不少学者认为其表达失控可促进肿瘤发生发展，研究发现miR⁃34a可通过调控多种靶分子参与肿瘤细胞的增殖与凋亡［4］，可能作为肿瘤抑制因子抑制肿瘤发生发展。成功的基因治疗主要取决于安全有效的传递系统［5］，目前常用的病毒载体虽然转染率高，但其在体内的安全性问题一直备受争议，而裸质粒等非病毒载体又存在靶向性差，转染率低等诸多问题［6］。因此寻求非病毒、非侵入性、靶向基因递送方式十分重要。阳离子超声微泡作为一种新型非病毒载体，可通过电荷相互作用携带具有阴离子磷酸骨架的DNA［7-8］，联合超声辐照，产生空化效应、声孔效应等增加了基因转染，克服了病毒载体存在的靶向性差、安全性低、免疫原性高等缺陷，可安全、有效增强基因转染［9-10］。GUO等［11］通过超声微泡介导的反义miRNA⁃224和miRNA⁃122a质粒转染非小细胞肺癌A549细胞，结果显示具有良好的转染效率，转染后的细胞生长，侵袭和集落形成能力均受到抑制，与对照组相比差异有显著性（P＜0.05）；过新民等［12］利用超声微泡介导了miR⁃199a对人肝癌细胞HepG2细胞的转染，转染效率达（26.31±0.72）%。

本实验以阳离子超声微泡为媒介，通过静电吸附，携载基因，外源性引入miR⁃34a到肿瘤组织中，探讨了超声介导下载miR⁃34a脂质微泡对小鼠U14宫颈癌皮下移植瘤的抑制作用。通过绘制肿瘤生长曲线，计算抑瘤率，检测相关基因及蛋白表达等方面，评估不同组别的抑瘤效果。实时荧光定量PCR结果显示载miR⁃34a阳离子脂质微泡组的miR⁃34a表达上调，说明我们通过载基因阳离子脂质微泡联合超声定位辐照成功地将miR⁃34a引入靶组织，JI等［13］也成功地利用微泡联合超声辐照介导了miR⁃133a对乳腺癌移植瘤的转染，这种有效并无创的转染是微泡经过血液循环，到达肿瘤组织，在超声定位辐照下，产生的空化效应及声孔效应等生物学反应，造成细胞膜损伤及膜通透性的改变，从而促进了基因的有效运输。有研究［14］报道miR⁃34a以碱基互补配对的方式与靶基因转录产物部分或者完全互补，导致转录产物被剪切或翻译抑制，从而抑制细胞增殖，促进凋亡，本实验各组小鼠肿瘤生长情况显示，载miR⁃34a阳离子脂质微泡组的肿瘤生长明显较缓，这可能与我们外源性引入miR⁃34a相关，调节miR⁃34a在肿瘤组织中的表达后，在转录后水平抑制了靶基因的翻译，从而减缓并抑制肿瘤的发生发展。

图5 各实验组小鼠肿瘤组织相关蛋白表达量比较Fig.5 Comparison of expression levels of related proteins in experimental mice

为了了解外源性引入miR⁃34a表达后，具体是通过哪些途径来达到肿瘤抑制效果的，我们通过免疫组化及实时荧光定量PCR实验技术检测了肿瘤组织中相关蛋白及基因的表达，结果显示载miR⁃34a阳离子脂质微泡组Bax表达上调，c⁃Met表达下调；Bax是人体最主要的凋亡蛋白之一，其过度表达可拮抗Bcl⁃2的保护效应，使细胞趋于死亡［15］，在LIN 等［16］的研究中显示bcl⁃2基因的3′非翻译区存在潜在miR⁃34a结合位点，说明miR⁃34a极有可能通过调控Bcl⁃2/Bax信号通路，来促进肿瘤细胞的凋亡；受体酪氨酸激酶c⁃Met是一种由c⁃met原癌基因编码的蛋白产物，为肝细胞生长因子受体，在多种恶性肿瘤中异常表达，与肿瘤细胞生长、侵袭、转移有着密切关系［17］，BEZAWY等［18］研究表明miR⁃34a可通过下调c⁃Met来达到抗肿瘤作用；也就是说利用微泡联合超声辐照引入miR⁃34a在肿瘤组织中高表达后，可能通过调控Bcl⁃2/Bax信号通路，下调c⁃Met表达来达到一定的治疗效果。当然还可能存在其他的抑制途径及更详细的调控机制需要后期实验来进一步验证。

综上所述，本实验成功制备了载miR⁃34a阳离子脂质微泡，利用超声定位辐照，作用于小鼠U14皮下移植瘤，介导了miR⁃34a对肿瘤组织的转染，结果显示载miR⁃34a阳离子脂质微泡能有效抑制肿瘤生长，促进肿瘤细胞凋亡，为肿瘤的基因治疗提供了新思路。但这种非侵入性基因转染治疗肿瘤的效率及安全性的提高还需要后期大量实验来探索与验证。