二咖啡酰基奎宁酸MQA抗MPP+诱导的SH-SY5Y细胞损伤作用研究

信小兵 ，李林 ，田星 ，张珂 ，刘丹妮 ，王航宇 ，王金辉 ，2*

（1石河子大学药学院/新疆植物药资源利用教育部重点实验室，新疆 石河子 832002；2哈尔滨医科大学药学院，黑龙江 哈尔滨 150081）

帕金森病（Parkinson's Disease，PD）是一种严重困扰人们健康的神经退行性疾病，多发于中老年人群。目前，在我国60岁以上人群中PD患病率大于1%。研究表明，PD是一种由于黑质－纹状体多巴胺能神经元变性、坏死，而导致以震颤、肌僵直和运动迟缓等临床症状为特征的神经变性疾病[1]。目前，对帕金森病的治疗还没有特效药，已经上市的药物都因为疗效不佳或毒副作用大较难满足要求。因此，寻找具有神经保护作用的天然药物活性成分对于PD的治疗很有意义。

1，5-O-二咖啡酰-3-O-（4-苹果酸甲酯）-奎宁酸 （1，5-O-dicaffeoyl-3-O-（4-malic acid methyl ester）-quinic acid，MQA）是从牛蒡根中提取分离得到的一种二咖啡酰基奎宁酸类化合物[2]。目前报道这类化合物具有许多的生物活性，如抗氧化、抗菌、抗肿瘤和抑制α糖苷酶的作用[3-4]。研究表明[5]二咖啡酰基奎宁酸类化合物可抑制Aβ42诱导的SH-SY5Y细胞损伤。在此基础上，本实验将在1-甲基-4-苯基-吡啶离子（1-methyl-4-phenylpyridinium，MPP+）诱导的SH-SY5Y细胞损伤模型上，建立体外PD模型，考察MQA抗MPP+诱导的细胞损伤作用及其作用机制，为进一步开发全新治疗帕金森病的药物打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品及主要试剂

MQA单体（由本实验室自制，纯度 98%）；小牛血清（杭州四季青生物制品公司，批号：150520）；DMEM 培养基（GIBCO公司，批号：129007）；山羊抗小鼠抗体（批号：127655）、山羊抗兔抗体（批号：129256）、β-actin抗体（批号：16A00205）均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；AMPKβ1/2抗体（批号：57C12）、LC3A/B 抗体（批号：D3U4C）、Beclin-1抗体（批号：D40C5）均购自Cell Signaling Technoligy公司；蛋白裂解液（Radio Immunoprecipitation Assay，RIPA，批号：20160420）、苯甲基磺酰氟（Phenyl methane sulfonyl fluoride，PMSF，批号：20160328）、蛋白浓度测定试剂盒（bicinchoninic acid，BCA，批号：20151225）、噻唑蓝（MTT，批号：705B0514）、二甲基亚砜（DMSO，批号：302A0319）均购自北京索莱宝科技有限公司。

1.1.2 主要仪器

CO2培养箱（Thermo Scientific公司）；离心机（上海安亭TDL-40B）；DYCZ-24DN制胶器（北京六一生物科技有限公司）；DYCZ-40D型电泳仪（北京六一生物科技有限公司）；power wave XS2酶标仪（美国BIO-RAD公司）；TDZ5-WS多管架自动平衡离心机（湘仪离心机仪器有限公司）；96孔细胞培养板（美国Costar公司）；CAP8201分析天平（德国Sartorius公司）。

1.2 方法

1.2.1 建立MPP+所致的SH-SY5Y细胞损伤模型

取对数生长期的SH-SY5Y细胞，以1.0×105/mL密度接种于96孔板内，100 μL/well，细胞贴壁培养24h后加入终浓度为 0.01、0.2、1、2.5、5 和 10 mol/L的MPP+，再置于5%CO2，37℃继续培养24 h。然后向细胞液中加入MTT溶液（终浓度为0.5 mg/mL），于37℃下共同孵育4 h。弃去上清液，加入DMSO溶液，150 μL/well，振荡溶解后使用酶标仪于490 nm处测定其吸光度（OD）值，并按照下列公式计算细胞存活率（cell viability）%，每组设3个复孔，实验重复4次。

细胞存活率%=（样品组OD值的平均值/对照组OD值的平均值）×100%。

1.2.2 MQA抗MPP+诱导的SH-SY5Y细胞损伤模型

取对数生长期的SH-SY5Y细胞，以1.0×105/mL密度接种于96孔板内，100 μL/well，细胞贴壁培养24h后加入终浓度为 10、20、40、80 μmol/L 的MQA。处理2 h后，加入浓度为2.5 mmol/L的MPP+，置于5%CO2，37 ℃继续培养24 h。然后向细胞液中加入MTT溶液（终浓度为0.5 mg/mL），于37℃下共同孵育4 h。弃去上清液，加入DMSO溶液，150 μL/well，振荡溶解后使用酶标仪于 490 nm处测定其吸光度（OD）值，并按照下列公式计算细胞存活率（cell viability）%，每组设3个复孔，实验重复4次。

细胞存活率%=（样品组OD值的平均值/对照组OD值的平均值）×100%。

1.2.3 Western Blot实验Western blot检测AMPKβ1/2、LC3A/B、Beclin-1蛋白的表达

细胞分为正常组、模型组（2.5 mmol/L MPP+24 h）、MQA 低剂量组（MQA 20 μmol/L 2 h+2.5 mmol/L MPP+24 h）、MQA 中剂量组（MQA 40 μmol/L 2 h+2.5 mmol/L MPP+24 h）、MQA 高剂量组（MQA 80 μmol/L 2 h+2.5 mmol/L MPP+24 h）。各组细胞 以 1.5×105/mL起始浓度接种于培养瓶，待细胞贴壁，培养48 h后，弃去培养基，收集细胞悬液于离心管中，1000 r/min离心5 min，弃去上清液，用 1/2体积的PBS悬浮后，再次离心，加入适量细胞裂解液，4℃裂解30～60 min后使其充分裂解，裂解完全后进行离心，以12000 r/min，4℃离心10 min，取上清液，提取总蛋白。用BCA蛋白定量法测定蛋白浓度，进行蛋白定量，沸水煮15 min，使蛋白变性，冷却至室温以后保存在-20℃冰箱中，备用。进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据蛋白需要适时停止电泳，取出电泳凝胶，按照所对应的分子量切割进行转膜，封闭，置于稀释过的AMPKβ1/2、LC3A/B和Beclin-1一抗溶液中，4℃过夜后，再取出用TBST液漂洗6次后，相应加入稀释后的二抗溶液，摇床上杂交1 h，取出洗膜，加入ECL，上机检测。采用ImageJ图像分析软件测定条带的光密度，计算灰度值。

1.3 统计学处理

实验数据应用SPSS17.0统计分析软件进行处理，数值用±S表示，两组间的比较采用单因素方差分析 （one-way ANOVA） 及 T检验（Students t-test），P＜0.05 即认为具有显著差异，P＜0.01 为差异有极显著性，P＞0.05为差异无显著性。

2 实验结果

2.1 MPP+诱导 SH-SY5Y细胞损伤模型结果

由图1可知，在MPP+诱导的SH-SY5Y细胞损伤模型中，实验结果表明，随着MPP+浓度升高，细胞存活率下降，且呈现计量依赖性。由SPSS统计软件处理得出，MPP+浓度为2.5 mmol/L时细胞的存活率为56.07%±5.11%，与正常有极显著性差异（P＜0.01）。MPP+浓度为2.5 mmol/L以上时，虽然与正常组有极显著性差异（P＜0.01），但是浓度过高，从节省试剂的角度考虑，本实验选取2.5mmol/L作为细胞损伤模型的浓度。

图1 不同浓度MPP+作用细胞的存活率Fig.1 Survival rate of MPP+cells with different concentrations

2.2 MQA抗MPP+诱导的SH-SY5Y细胞损伤作用

由图2可知，与单独用2.5 mmol/L MPP+诱导的细胞损伤模型相比，MQA处理后细胞存活率明显上升，随着MQA的浓度升高，细胞存活率升高，且呈现计量依赖性，表明MQA具有抗MPP+诱导的细胞损伤作用。由SPSS数据处理软件得出，在各给药各组中，MQA浓度为10 μmol/L时，给药组与模型组没有显著性差异，MQA浓度为 20、40、80 μmol/L时，与模型组比较有极显著性差异（P＜0.01），表明MQA浓度为20、40、80 μmol/L时，抗细胞损伤作用较明显，故后续Western Blot实验给药浓度定为：20 μmol/L（低剂量）、40 μmol/L（中剂量）、80 μmol/L（高剂量）。

图2 MQA抗MPP+诱导的SH-SY5Y细胞损伤作用Fig.2 MQA anti MPP+induced SH-SY5Y cell injury

2.3 Westrrn blot实验结果

由图3可知，与正常组相比，在2.5 mmol/L诱导的模型组中AMPKβ1/2蛋白表达明显升高（P＜0.01），与模型组相比各给药组中AMPKβ1/2蛋白表达明显下降（P＜0.01），且随着 MQA剂量的增加 AMPKβ1/2蛋白表达依次下降，且呈现一定的计量依赖性；与正常组相比，在2.5 mmol/L诱导的模型组中LC3A/B蛋白表达明显升高（P＜0.01），与模型组相比各给药组中LC3A/B蛋白表达明显下降（P＜0.01），且随着MQA剂量的增加LC3A/B蛋白表达依次下降，且呈现一定的计量依赖性；与正常组相比，在2.5 mmol/L诱导的模型组中Beclin-1蛋白表达明显升高（P＜0.01），与模型组相比各给药组中Beclin-1蛋白表达明显下降（P＜0.01），且随着MQA剂量的增加Beclin-1蛋白表达依次下降，且呈现一定的计量依赖性。

图3 MQA对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞AMPKβ1/2、LC3A/B、Beclin-1表达的影响Fig.3 Effects of MQA on the expressions of AMPKβ1/2、LC3A/B、Beclin-1 induced by MPP+in SH-SY5Y cells

3 讨论

1-甲基-4-苯基-吡啶离子（1-methyl-4-phenylpyridinium，MPP+）是线粒体复合物Ⅰ的抑制剂，实验结果表明，MPP+能造成SH-SY5Y细胞损伤，可作为帕金森病神经元细胞损伤的模型。在MPP+诱导的细胞损伤模型中给药（MQA），实验结果表明各给药组与模型组相比，细胞存活率均提高，且随着剂量的增大逐渐提高。因此二咖啡酰基奎宁酸MQA具有抗MPP+诱导的SH-SY5Y细胞损伤作用。

自噬是自噬溶酶体对其包裹的细胞质内含物进行降解的一种分解代谢过程，自噬能够清除错误折叠的蛋白质，减少蛋白质在神经元内聚集，可有效预防帕金森病等神经退行性疾病的发生。然而，自噬过度活跃会引起自噬应激，可能会引起神经细胞的死亡，从而导致帕金森病的发生。越来越多研究表明[6]细胞自噬也参与了帕金森病的发病过程。

腺苷酸激活的蛋白激酶（AMPK）是一种高度保守的蛋白激酶，它在能量平衡中起关键性作用。在热激，缺氧，缺血，饥饿等环境因素的刺激下，引起AMP/ATP浓度比的升高，AMP/ATP浓度比的升高可以激活 AMPK。活化的 AMPK催化 ULK1第 317、467、555、637和777位丝氨酸发生磷酸化，使形成ULK1-Atg13-FIP200复合物，从而促进自噬[7]。

Beclin-1 可与 Barkor、Vps34、Vps15 结合 ，形成PI3K复合物III。该复合物是吞噬泡形成所必需的，因此Beclin-1是调控自噬的关键因子[8]。LC3参与了自噬体膜的形成，包括两种可相互转化的形式即LC3-I和LC3-II。细胞内新合成的 LC3经过加工，成为胞浆可溶形式的 LC3-I，后者经泛素化加工修饰，与自噬体膜表面的 PE结合，成为膜结合形式的 LC3-II。LC3-II定位于前自噬体和自噬体，是自噬体的标志分子，随自噬体膜的增多而增加[9]。

在细胞损伤模型组中，AMPKβ1/2、Beclin-1蛋白和LC3蛋白高表达或许与SH-SY5Y细胞的自噬有关。MQA 可降低 AMPKβ1/2、LC3A/B、Beclin-1蛋白的表达量。由此推测，MQA抗MPP+诱导SH-SY5Y细胞损伤作用可能与抑制细胞自噬有关。