秦皮乙素促进成骨细胞分化延缓增龄性骨质疏松的研究

王继荣 暴一众 杨舟鑫 吕晓玲 胡细连 王国付

浙江医院，浙江省老年医学重点实验室，浙江 杭州 310013

随着人口老龄化，目前我国50岁以上的骨质疏松及骨量减少的人数逐年增多，预计到2050年，此数量将达2.12亿[1]。目前应用于骨质疏松症的药物主要为西药，但这类药物多数具有严重或潜在的不良反应[2-3]。中医药及天然药物在预防骨质疏松症方面具有很好的发展潜力。现代药理学研究显示秦皮乙素(esculetin，Esc)具有多种药理作用，如抑制5-脂氧合酶、抗炎、抗氧化、抗肿瘤等[4]。有研究发现秦皮乙素对破骨细胞分化有调控作用[5]，但其对成骨细胞分化尤其是整体动物中对骨量维持的作用尚不得而知。为了避免雌激素的影响，本研究利用增龄性骨质疏松症小鼠模型观察秦皮乙素对骨量维持的作用，并进一步利用骨髓来源的间充质干细胞(bone marrow derived stroma cell，BMSCs)初步探讨其对成骨细胞分化的影响。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1实验动物：7月龄雄性C57BL/6小鼠，SPF级，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号：SCK(京)2012-0001，合格证编号：11400700163033。在浙江大学城市学院动物实验中心饲养，医学实验动物环境设施为SPF级。

1.1.2主要药品与试剂：秦皮乙素(成都瑞芬思生物科技有限公司)，RNA提取试剂盒(德国Qiagen公司)，逆转录试剂盒(TOYOBO公司)，荧光定量PCR试剂盒(TOYOBO公司)，HE染液(碧云天生物技术研究所)，茜素红染液(美国Sigma公司)，β-甘油磷酸钠(美国Sigma公司)，地塞米松(美国Sigma公司)。

1.1.3主要仪器设备：小动物骨密度及体成分分析仪(韩国InAlyzer)，Roche480荧光定量PCR仪(德国Roche公司)，生物安全柜(美国Thermo公司)，石蜡包埋机与切片机(德国Leica公司)，显微镜(日本Olympus公司)。

1.2 实验方法

1.2.1动物分组与给药：取7月龄C57BL/6小鼠24只，随机分为对照组、秦皮乙素200 mg/kg与400 mg/kg给药组，每组8只。对照组灌胃给予生理盐水，秦皮乙素组分别灌胃给予秦皮乙素溶液，药物浓度分别为40 mg/mL与80 mg/mL，给药体积为0.5 mL/100 g。

1.2.2取材及样品制备：给药3个月后，用3%戊巴比妥钠(4 mL/kg)腹腔注射麻醉处死小鼠，75%酒精消毒后，于生物安全柜中分离小鼠左侧股骨与胫骨组织，剔除肌肉组织，用1 mL注射器抽取已经预先配好的小鼠间充质干细胞完全培养液反复冲洗骨髓腔，直至骨发白，收集冲洗液，反复吹打使细胞打散，移至灭菌的10 mL离心管中，4℃1600rpm离心5 min，弃上清，用小鼠间充质干细胞完全培养基重悬细胞，调整细胞密度至5×106/mL，接种到T25培养瓶，置于5% CO2、37 ℃、饱和湿度95%的培养箱中培养3 d，轻轻吸出上清，并加入新鲜培养液继续培养，获得骨髓来源的间充质干细胞。将右侧胫骨组织置于4%中性福尔马林，固定72 h后，14% EDTA(pH7.4)脱钙，每3 d换一次脱钙液，连续脱钙1个月。

1.2.3指标检测：(1)骨密度检测：取固定好未脱钙的胫骨组织，置于InAlyzer小动物骨密度测定仪中扫描。(2)茜素红染色：上述BMSCs细胞种于6孔板中，添加成骨诱导液(10 mmol/L β-甘油磷酸钠，0.05 mmol/L VC，100 mmol/L地塞米松)诱导，每3 d换液一次，28 d后PBS冲洗3次；95%酒精固定15 min，蒸馏水冲洗后用茜素红染液(0.1 mmol/L的Tris-HCl 100 mL(pH=8.3)，加入0.1 g茜素红S)于37 ℃染色30 min，蒸馏水冲洗后晾干拍照。(3)HE染色：脱钙完成后的胫骨组织用PBS清洗3次，然后进行常规梯度酒精脱水，苯透明，石蜡包埋，待石蜡凝固后Leica切片机进行连续切片，厚度为5 μm。待切片黏附到载玻片后，按照标准方法进行HE染色，染色后进行封片并在光学显微镜下观察拍照。(4)荧光定量PCR：利用RNA提取试剂盒提取各小鼠BMSCs总RNA，用TOYOBO的逆转录体系合成cDNA，并使用TOYOBO的PCR Master Mix来进行荧光定量PCR。使用Light Cycler480(Roche)实时定量PCR扩增仪进行 PCR扩增。以β-actin为内参，分析目的基因的相对表达量。扩增产物的特异性通过绘制融解曲线来进行验证。用于实时定量PCR的引物见表1。

1.3 统计学处理

表1 定量PCR引物

2 结果

2.1 秦皮乙素对小鼠胫骨骨密度的影响

图2 各组小鼠胫骨组织HE染色比较Fig.2 H& E staining of tibia in each group

图3 各组小鼠成骨细胞茜素红染色及定量比较Fig.3 Alizarin-red staining of osteoblasts and quantitative determination in each group

利用小动物骨密度及体成分分析仪检测各组小鼠胫骨骨密度，结果如图1所示，200 mg/kg秦皮乙素组骨密度与对照组相比略有增加，而秦皮乙素400 mg/kg组小鼠胫骨骨密度明显高于对照组。

图1 各组小鼠胫骨骨密度比较Fig.1 Bone mineral density of the tibia in each group

2.2 秦皮乙素对骨组织形态的影响

取小鼠胫骨组织做石蜡切片与HE染色，结果如图2所示，10月龄对照组小鼠骨髓腔中骨小梁大量丢失，充斥着大量脂肪细胞；而秦皮乙素200 mg/kg组小鼠胫骨中可见少量骨小梁，但仍有大量脂肪细胞；秦皮乙素400 mg/kg组小鼠胫骨中骨小梁数量与对照组相比明显增多，仅见少量脂肪细胞。以上结果说明秦皮乙素可以延缓小鼠骨量丢失。

2.3 秦皮乙素影响BMSCs矿化结节形成能力

分离BMSCs细胞，成骨诱导液诱导28 d后进行茜素红染色，染色结果显示秦皮乙素400 mg/kg组BMSCs的矿化结节明显多于对照组，而200 mg/kg组与对照组相比差异并无统计学意义(P>0.05)，见图3，提示秦皮乙素促进成骨细胞矿化结节形成能力。

2.4 秦皮乙素对成骨细胞分化标记基因表达的影响

图4 秦皮乙素对成骨细胞分化标记基因表达的影响Fig.4 Effect of esculetin on the expression of osteoblast differentiation marker genes

分离BMSCs细胞进行荧光定量PCR，结果如图4所示，秦皮乙素剂量依赖地促进成骨细胞分化标记基因ALP、BSP、Col1与Runx2的表达。同时对经典Wnt信号靶基因Dkk1与转录因子Lef1的表达进行检测，结果发现秦皮乙素同样促进Dkk1与Lef1的表达，此结果提示秦皮乙素可能通过经典Wnt信号调控成骨细胞分化。

3 讨论

女性较男性更易出现骨质疏松，因为绝经后的妇女雌激素缺乏，导致成骨细胞分泌核因子-κB受体活化因子配体(receptor activator for nuclear factor-κ B ligand，RANKL)，促进破骨细胞分化，使骨吸收加速，而骨形成没有相应增加，最终引起骨小梁结构改变，骨脆性增加[6-7]。因此，雌激素缺乏引起骨重建负平衡，使骨量丢失加重，是骨质疏松的一个重要原因。尽管雌激素对于提高骨密度、降低骨折风险有很好的疗效，但是长期使用雌激素提高了患乳腺癌、子宫出血与心血管疾病的风险[8-9]。对于非雌激素缺乏引发的增龄性骨质疏松症的治疗仍是一项任重而道远的工作。C57BL/6小鼠骨量在4～8个月时达到高峰，随后随着年龄增大骨量逐渐丢失，类似于增龄性骨质疏松症[10-11]。本研究利用C57BL/6小鼠构建增龄性骨质疏松症模型，选取骨密度高峰期7月龄进行干预，避免了雌激素的影响。本实验结果发现200 mg/kg秦皮乙素组小鼠胫骨骨密度虽有略微增加，但差异并无统计学意义，而且BMSCs矿化结节形成能力也并未见明显增强。秦皮乙素400 mg/kg能显著延缓小鼠的骨量丢失，10月龄时与对照组相比，骨小梁数量明显增多，且脂肪空泡减少。

目前应用于骨质疏松症的药物主要为西药，但这类药物多数具有严重或潜在的不良反应，如长期使用双膦酸盐会导致严重的骨失常、肌肉疼痛与骨折[12-13]。中药及天然药物在预防骨质疏松症方面具有很好的发展潜力。对传统中药进行2次开发，特别是开发有效部位制剂，其质量标准易于和国际公认标准接轨，是中药现代化发展的趋势之一。本研究中的秦皮乙素是一类广泛存在于自然界植物中的香豆素类化合物，容易获得，且具有安全无毒副作用，具有一定的临床应用价值。

成骨细胞骨形成与破骨细胞骨吸收动态平衡对维持生理状态骨代谢平衡具有关键作用，目前临床治疗骨质疏松策略是抑制骨吸收，而针对骨形成的靶点药物尚未有很好的应用[14]。有研究发现秦皮乙素通过调控NFATc1与c-Fos的表达影响破骨细胞分化与功能[5]。本研究发现秦皮乙素可以剂量依赖性地促进BMSCs细胞的矿化结节形成能力，同时提高成骨细胞分化标记基因ALP、BSP、Col1与Runx2的表达，提示秦皮乙素可以促进成骨细胞分化能力，对于骨形成靶点药物的研发具有一定的提示作用。

Wnt信号通路是生物体内广泛存在的信号通路，激活经典Wnt信号通路引起β-actin蛋白在细胞质内的稳定、积累并进入细胞核，增加下游淋巴样增强因子1(lymphoid enhancer-binding factor 1，Lefl)和T细胞因子(T cell factors，TCF)等转录因子的活性，促进下游基因转录[15]。因此经典Wnt信号通路在胚胎的骨骼发育和个体的骨量维持方面发挥着至关重要的作用[16]。本研究发现秦皮乙素剂量依赖性地增加了BMSCs细胞中经典Wnt信号的靶基因Lef1与Dkk1的表达，因此笔者猜测秦皮乙素可能参与调控经典Wnt信号。

综上，本研究利用增龄性骨质疏松症小鼠模型发现秦皮乙素可能通过调节经典Wnt信号促进成骨细胞分化，从而延缓骨量丢失，但详细的分子机制仍待进一步研究，因此开发新的治疗骨质疏松症药物仍是一项任重而道远的工作。