响应面在加拿大一枝黄花挥发油提取中的应用

(徐州生物工程职业技术学院，江苏徐州，221006)

加拿大一枝黄花属菊科多年生草本植物，原产北美，于1935年作为观赏性植物引入我国[1]。最初在上海、南京等南方地区栽培。因花色泽靓丽，常用于插花中的配花。而后因为生长环境适宜，没有约束、管理，逐渐在农田的抛荒地、建筑工地、果园以及田边地头、铁道两边、河边河滩等蔓延开来，一发不可收拾，严重破坏了当地的生态环境，并对物种多样性构成严重威胁。现在浙江、安徽、江苏、福建、江西、四川、山东、河南、湖北、湖南、广西、广东、海南、重庆、贵州、云南等17个省市都出现了加拿大一枝黄花的踪影。当地部门抓紧开展了铲除、焚毁加拿大一枝黄花的行动，并严令禁止种植、运输、买卖等活动。

虽然加拿大一枝黄花是外来入侵物种，但其功效也不少，是一种有用的资源。加拿大一枝黄花中含有多炔类、二萜、皂苷类、黄酮类、苯丙酸、挥发油等化学成分，有抗氧化、抗炎、抗菌、利尿、抗肿瘤等作用[2]。在国外就认定其有一定药用价值，被允许全草入药。对糖尿病、慢性肾病、风湿病等疾病的治疗就有很好的疗效，可作为抗炎剂使用。根据它的抗氧化活性，可以将其作为抗生素、外激素等化学制剂的代用品，因此用其研制一些护肤品、化妆品等。使用最多的还是它的挥发油。加拿大一枝黄花的根、茎、叶和花都可以提取挥发油。利用它的抗菌效果可以制作手工皂，特别对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌有效，对金黄色葡萄球菌也有一定疗效。

此试验主要采用星点设计-效应面法优选萃取加拿大一枝黄花挥发油的条件。响应面可以直观地判别优化区域，观察其最优化点，找出最优值。将体系的响应(如萃取率)作为一个或多个因素(如萃取剂浓度、酸度等)的函数，运用图形技术将这种函数关系显示出来[3]。本试验主要采用了三因素三水平的方法共设17个实验，建立多元线性回归方程绘出三维图形，得出最优提取方法。

1 提取挥发油所需材料和仪器

1.1 材料

加拿大一枝黄花(采自安徽省黄山市)，经鉴定加拿大一枝黄花为菊科植物加拿大一枝黄花的干燥根茎，其质量标准符合《中华人民共和国药典》2015版的各项规定。

蒸馏水，为实验室自制的蒸馏水，经鉴定符合《中华人民共和国药典》2015版的各项规定。

1.2 仪器

DF-101T-5L磁力搅拌器(力辰科技)、DZF-6020A真空干燥箱(力辰科技)、600W-900W超声波发生器(深圳市广源达公司)、TY-8L粉碎机(天宇机械)。

2 方法

2.1 加拿大一枝黄花挥发油的制备

在容器中加入水，将洗净、干燥的加拿大一枝黄花根据需要粉碎，放入蒸馏水中；容器的外壁连接换能器振子或将振子密封于不锈钢盒中投入容器中，开启超声波发生器。

2.2 挥发油空白回收率的测定

用移液器精密量取挥发油2mL，转移至1000mL烧瓶中，加蒸馏水400mL，同时加入少量碎瓷片，连接挥发油测定器。平行测定3次，结果分别为0.89,0.90,0.92mL。计算空白回收率为90.33%[4]。空白回收率=平均得油量/挥发油投入量×100%。

2.3 响应面优化实验设计

本实验根据单因素试验选定超声时间28.45min，40,51min，55min;提取温度36.34℃,45,53℃,66℃；pH值:5,7,9为影响值，并用1、0、-1为替代值，考察对挥发油萃取率的影响。并根据效应面的星点设计原理设3个因素的3个水平，共取17份样本进行试验。试验水平见表1，试验设计与结果见表2。

2.4 模型拟合与方差分析

以提取率Y为因变量，超声时间A,萃取温度B,pH值C为自变量，对实验最终所取得的数据运用Design Expert 10(32-bit)软件进行拟合，通过相关系数(r)来判断对模型的拟合程度[5]。用二项式和多元线性回归的方法来进行拟合并用ANOVA进行分析。方差结果见表3。

由表3分析可得，二次回归方程模型P=0.0042，为显著(P<0.05)，失拟项P=0.1184，为不显著(P>0.05)。运用陈建中等在《响应面试验优化双水相萃取大吴风草总黄酮工艺及抑菌活性测定》中所用方法[6]，通过该模型的方差分析可知，因素B(P=0.3374)和因素C(P=0.4918)对萃取率Y的影响不显著，而因素A(P=0.0068)对萃取率Y的影响极显著，即提取温度和pH值对挥发油的萃取率影响不显著，而超声时间显著影响了挥发油的萃取率。各因素对加拿大一枝黄花挥发油影响的效应大小依次为超声时间>提取温度>pH值。通过回归模型进行拟合，超声时间、提取温度、pH值这三个试验因素对响应值Y的影响可用以下多元二项式表示：

Y=-199.98492+7.05786A+2.19749B+21.17016C+0.010598AB+0.084307AC-0.063799BC-0.096046A2-0.025938B2-1.51319C2。

表1 挥发油提取工艺试验因素水平表

表2 挥发油提取工艺试验设计表

表3 挥发油提取工艺拟合回归方程方差分析表

注：*差异显著，P<0.05；**差异极显著，P<0.01

2.5 效应面优化及预测条件评价

通过运用Design Expert 10(32-bit)软件对结果进行分析汇总，绘制得到预测的加拿大一枝黄花挥发油萃取率与三个因变量间的等高线和三维效应曲面图(详细见图1、图2和图3)。

R1:加拿大一枝黄花挥发油提取率；A:A超声提取时间；B:B提取温度图1 超声提取时间和提取温度对挥发油提取率影响的等高线和效应曲面图

R1:加拿大一枝黄花挥发油提取率；A:A超声提取时间；C:C pH值图2 超声提取时间和pH值对挥发油提取率影响的等高线和效应曲面图

R1:加拿大一枝黄花挥发油提取率；B:B提取温度；C:C pH值图3 提取温度和pH值对挥发油提取率影响的等高线和效应曲面图

如图1、2、3所示，萃取率的响应面开口向下，萃取率和超声时间、萃取温度、pH值3个因素呈现明显的函数制约关系。随着各个因素水平的不断增加，响应值萃取率也在随之不断变化，并出现了最大值。A、B、C三个因素水平增加，萃取率Y也随之增加；当达到一个最大值后，萃取率Y就逐渐下降，这个最大值就是最优萃取条件。借助Design Expert 10(32-bit)中多元二次回归模型对加拿大一枝黄花挥发油萃取率进行估算，对二次抛物线函数模型进行极值分析，预测三因素的最佳组合坐标Z(0.14285,1,0.456)，及超声时间为43min，提取温度为37℃，pH值为7.45，此时模型最大预测值Y=71.9864%。

2.6 验证试验

精密称取加拿大一枝黄花10.00±0.05g，共取3份，按照上述优选的提取工艺条件进行试验，将预测值(71.97%)与实测平均值(71.963%，RSD为0.23%)进行比较，计算综合评分的偏差为0.0097%。详见表4。

表4 提取工艺验证结果(n=3)

注：偏差值=(预测值-实测平均值)/预测值×100%

3 结论

3.1 挥发油提取方法的选择

制备挥发油的常用方法有超声萃取法、水蒸气蒸馏法、溶剂萃取法等，考虑到操作的可行性及可控性，本试验采用超声萃取法提取加拿大一枝黄花挥发油。此方法无需高温，常压萃取，安全性好，操作简单易行，萃取效率高，具有广谱性。超声波萃取对溶剂和目标萃取物的性质关系小，减少能耗。且杂质少，有效成分易于分离、净化。萃取工艺成本低，综合经济效益显著[7]。

3.2 展望

本试验从超声时间、萃取温度、pH值三方面因素设计实验，讨论了对加拿大一枝黄花提取利率的影响。试验得超声时间为43min，提取温度为37℃，pH值为7.45时的条件下提取率最大，提取得到的挥发油的量最多。因为加拿大一枝黄花挥发油的功效很多，所以这一资源可以更好地应用在日用化工、医药、保健品、化妆品等方面，应用前景很广。