UPLC-MS/MS同时测定菟丝子中6种黄酮类成分的含量

张威，付之恬，刘宸光，王博伦，刘润东，范荣华

（1.沈阳医学院公共卫生学院预防医学专业2015级，辽宁 沈阳 110034；2.药学专业2017级；3.预防医学专业2014级；4.卫生检验教研室）

传统中药菟丝子为旋花科植物菟丝子（Cuscuta chinensis Lam.）的干燥成熟种子。传统用于阳痿遗精、尿有余沥、遗尿尿频、腰膝酸软、目昏耳鸣、肾虚胎漏、胎动不安、脾肾虚泻，外治白癜风等［1］。现代药理学研究表明，菟丝子具有壮阳、提高垂体对促性腺激素释放激素（LRH）及卵巢对促黄体生成素（LH）反应性、降压、增强心脏收缩力、延缓白内障形成等作用［2-4］。

菟丝子主要包含黄酮类、糖苷酸类、木脂素类与多糖类成分［5-8］。其中黄酮类化合物为菟丝子的主要活性成分，主要有紫云英苷、金丝桃苷、槲皮苷、槲皮素等［9］。药理研究表明，菟丝子黄酮类成分具有抗衰老、增强机体免疫、促进成骨细胞活性、保护血管与调节内分泌等作用［10-12］。其中的槲皮苷具有抗氧化清除自由基、镇静催眠、抗动脉粥样硬化［13-15］等多种生物学活性，槲皮素对去甲肾上腺促人血管平滑肌细胞增殖有抑制作用［16］。由此可见，对菟丝子中黄酮类成分进行质量控制对其合理应用具有重要意义。目前对紫云英苷、金丝桃苷等黄酮类成分的检测主要包括高效液相色谱法及液相色谱-质谱联用法，但检测时间较长，灵敏度不高。因此，本文建立了菟丝子中的6种黄酮类成分含量的高效快速的超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS），检测快速、灵敏度高，将为菟丝子中药材的质量控制提供方法依据。同时我省是菟丝子药材的主产地，随着近年来不断发掘的菟丝子新的药理活性，建立准确、高效的菟丝子质量评价方法，使得我省对提高菟丝子的安全性评价研究方法水平，进一步优化菟丝子品种，促进菟丝子的临床合理应用具有重要意义。

1 仪器与材料

1.1 仪器 超高效液相色谱-串联质谱联用仪（美国Waters公司）；万分之一天平（德国Sartorius公司，BSA124S）；数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，KQ5200DV）；电子数显恒温水浴锅（上海宜昌仪器纱筛厂）；旋涡混合器（SilentShake，HYQ-2121A）；高速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司，HC-2062）。

1.2 材料 金丝桃苷（Hyperoside）、紫云英苷（Astragalin）、异槲皮苷（Isoquercitrin）、槲皮苷（Quercitrin）、山萘酚（Kaempferol）购自中国食品药品检定研究所；槲皮素（Quercetin，自制，HPLC归一化法测得质量浓度大于98%），同时通过核磁共振和质谱数据确证为槲皮素单体成分。菟丝子购买于沈阳市天益堂大药房。甲醇、甲酸（美国Sigma公司，HPLC级），实验用水为娃哈哈纯净水。

2 方法与结果

2.1 质谱条件 采用电喷雾离子源（ESI），负离子扫描模式下多反应离子检测模式（multiple reaction monitoring，MRM）；毛细管电压为3.0 kV，离子源温度为150℃，脱溶剂温度为400℃，脱溶剂气流量为700 L/h，锥孔气流量为50 L/h；碰撞气为氩气，压力为2.95×10-3mbar；准确质量校正采用NaCsI进行校正。

各化合物根据质谱数据确定待测物的定量参数见表1，二级质谱图见图1。

表1 6种黄酮类成分的质谱参数

图1 6种黄酮类成分的二级质谱图

2.2 色谱条件 色谱柱：Waters UPLC BEH C18色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相：A相：甲醇；B相：0.1%甲酸-水。梯度洗脱程序：0～5 min：55%B～20%B；5～5.01 min：20%B～55%B；5.01～6.5 min：55%B，流速：0.3 ml/min。进样量：5 μl；柱温：30℃。各峰与相邻峰的分离度均大于1.5，理论板数测得成分峰计算均不低于3 000。

2.3 对照溶液的制备 取各对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 ml分别含各对照品0.5 mg的混合储备液Ⅰ。精密量取混合储备液1.0 ml，置100 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得混合5μg/ml对照溶液Ⅱ。

2.4 供试溶液的制备 将菟丝子种子粉碎，取粉末约1.0 g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入水25 ml，称定重量，浸泡过夜，振摇混匀，加热回流1.5 h，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，涡旋混匀，取上清液经0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液5μl，UPLC-MS/MS进样分析。

2.5 标准曲线的制备 精密量取混合储备液Ⅱ制成浓度为 5、10、50、100、250、500 ng/ml的系列标准溶液，分别UPLC-MS/MS自动进样5μl，以标准溶液浓度（c）为横坐标，色谱峰面积（A）为纵坐标，绘制标准曲线。

结果表明，各化合物在各自的质量浓度范围内线性关系良好。见表2。

表2 6种黄酮类成分的线性范围、标准曲线及相关系数

2.6 精密度试验 UPLC-MS/MS自动进样对照溶液5μl，重复进样6次，记录色谱图，读取各色谱峰峰面积，得到6种黄酮化合物的峰面积RSD%分别 为 1.3%、0.8%、1.4%、0.9%、1.2%、1.7%，表明仪器精密度良好。

2.7 重现性试验 取菟丝子药材粉末，按“2.4供试溶液的制备”项下方法平行制备6份供试品溶液，进样UPLC-MS/MS，记录色谱图，读取各色谱峰峰面积，计算6种黄酮化合物含量的RSD%分别为1.5%、1.8%、1.7%、1.6%、1.9%、1.4%，表明方法重现性良好。

2.8 稳定性试验 按“2.4供试溶液的制备”项下方法制备1份供试品溶液，分别在室温放置0、2、4、6、8、12 h后进样，记录色谱图，读取各色谱峰峰面积，6种黄酮化合物峰面积的RSD%分别为1.2%、1.1%、1.2%、1.4%、1.3%、1.2%，结果表明供试溶液在室温放置12 h内稳定。

2.9 加样回收率试验 称取已知量的菟丝子样品（产地：辽宁沈阳）9份，每份0.5 g，精密称定，分别加入对照品溶液0.5、1.0、2.0 ml，每个样品平行3份，按“2.4供试溶液的制备”项下的方法操作，在上述色谱条件下进样分析，计算6种黄酮化合物的含量，计算加样回收率，各化合物的加样回收率实验结果分别为95.8%、98.2%、94.9%、97.1%、95.1%和95.7%（RSD分别为2.1%、2.2%、2.5%、2.4%、2.7%和2.2%）。

2.10 样品测定 取不同批次的菟丝子样品（产地：辽宁沈阳），按“2.4供试溶液的制备”项下的方法操作，UPLC-MS/MS自动进样供试溶液5μl，在上述色谱条件下进样分析，以标准曲线法计算各成分的含量，结果见表3。

3 讨论

3.1 质谱条件的选择 对待测物质6种黄酮化合物成分进行质谱条件优化，实验发现6种黄酮类化合物在正负离子监测下都能测定，但是在负离子条件下检测响应强于正离子条件，因此选择负离子反应监测。

3.2 液相条件的选择 为了获得更好色谱峰峰形，保留时间和灵敏度，分别对甲醇-水、乙腈-水的等度与梯度条件进行考察，结果表明以甲醇-水梯度洗脱系统色谱峰峰形好，响应高，背景噪音小，同时加入甲酸到水相系统中可以使色谱峰峰形对称性得到提高，通过考察不同含量的甲酸（0.1%、0.2%、0.3%、0.5%），最终确定液相系统为甲醇-0.1%甲酸水梯度洗脱，可达到理想的分离度。

表3 6种黄酮类成分的样品含量（n=3，×10-3mg/g）

因此本研究采用高效灵敏的UPLC-MS/MS技术对不同批次的菟丝子中6种黄酮类化合物成分进行了含量测定，该研究方法将为菟丝子中药材的质量控制提供方法依据，对提高菟丝子的临床合理应用具有重要作用。