粒细胞集落刺激因子的神经保护作用及临床试验研究进展

罗薇 舒斯云 马林 王斌

[摘要] 粒细胞集落刺激因子作为一种刺激骨髓粒系造血的生长因子，在临床上被用于治疗各种原因引起的粒细胞减少症。然而，越来越多体内外研究实验及临床试验表明粒细胞集落刺激因子通过激活多种信号转导通路在神经系统损伤性疾病中发挥神经保护作用，包括动员外周干细胞迁移至神經系统、减轻神经细胞凋亡、平衡炎症反应、促进神经干细胞再生及血管生成等，但也存在一定的争议。目前在脑卒中、肌萎缩性侧索硬化及脊髓损伤等神经系统疾病中采用粒细胞集落刺激因子治疗已进入临床试验阶段，在缺氧缺血性脑损伤新生动物模型中也证实其疗效。现将粒细胞集落刺激因子的神经保护作用及临床试验安全性及疗效作一综述。

[关键词] 粒细胞集落刺激因子；神经损伤疾病；新生儿缺血缺氧性脑损伤；神经保护；临床试验

[中图分类号] R743.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2018）14-0164-05

[Abstract] Granulocyte colony-stimulating factor， as a growth factor that stimulates bone marrow hematopoiesis， is clinically used to treat neutropenia caused by various causes. However， more and more in vitro and in vivo research experiments and clinical trials have shown that granulocyte colony-stimulating factor exerts neuroprotective effects in nervous system injury diseases by activating multiple signal transduction pathways， including mobilizing peripheral stem cells to migrate to the nervous system， reducing nerves apoptosis， balancing inflammatory responses， and promoting neural stem cell regeneration and angiogenesis， but there is also some controversy. Currently， the use of granulocyte colony-stimulating factor therapy in stroke， amyotrophic lateral sclerosis and spinal cord injury has entered clinical trials， and its efficacy has also been confirmed in a neonatal animal model of hypoxic-ischemic brain damage. The neuroprotective effects of granulocyte colony-stimulating factor and the safety and efficacy of clinical trials are reviewed.

[Key words] Granulocyte colony-stimulating factor； Nerve injury disease； Neonatal hypoxic-ischemic brain damage； Neuroprotection； Clinical trials

粒细胞集落刺激因子（Granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）是一种刺激骨髓粒系造血细胞增殖、分化和存活的生长因子，在临床上应用广泛，常用于原发性或继发性中性粒细胞减少症。越来越多的证据表明，粒细胞集落刺激因子易透过血脑屏障与其受体结合后发挥动员造血干细胞及骨髓间充质干细胞、抗凋亡、抗炎、促进神经元分化及血管发生等作用[1]。近年来，国内外应用粒细胞集落刺激因子治疗多种神经损伤性疾病已进入Ⅰ、Ⅱ期临床试验阶段；另外，粒细胞集落刺激因子在多种缺氧缺血性脑损伤新生动物模型中被证明在神经保护方面拥有巨大的前景。

1 粒细胞集落刺激因子及其受体

粒细胞集落刺激因子是由四个反向平行的α-螺旋组成的分子量为19.6 kDa的糖蛋白，由单个基因编码，位于17号染色体q21～22上，可由骨髓基质细胞、内皮细胞、巨噬细胞、成纤维细胞和星形胶质细胞等产生[2]。粒细胞集落刺激因子受体（Granulocyte colony-stimulating factor receptor，G-CSFR）是位于1号染色体p35～p34.3上的一种Ⅰ型膜蛋白，其胞外区域是由免疫球蛋白样结构域、细胞因子受体-同源结构域和三个纤连蛋白Ⅲ型结构域组成的复合结构。G-CSFR不仅表达在各种造血细胞，如嗜中性粒细胞及其前体、单核细胞、血小板、淋巴细胞和白血病细胞，同时也表达在非造血细胞上，如内皮细胞、滋养细胞、恶性实体肿瘤组织、神经元和神经胶质细胞等[3]。而在中枢神经系统中，该受体被证明表达于齿状回、嗅觉皮层和嗅球、海马CA3区等皮质层中的锥体细胞（尤其是Ⅱ和V层），小脑中的浦肯野细胞，脑室下区和小脑中央核等区域[4]。G-CSF结合其受体后激活细胞内多种信号转导通路激活下游底物，从而影响细胞的增殖、分化和存活，发挥动员造血干细胞及骨髓间充质干细胞、抗凋亡、抗炎、诱导神经发生及血管生成等神经保护作用。

2 G-CSF的神经保护作用

2.1 动员造血干细胞及骨髓间充质细胞

G-CSF可动员造血干细胞（hemopoietic stem cells，HSCs）及骨髓间充质细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs）从骨髓进入血液循环中发挥作用。G-CSF的使用可減少动物脑梗死面积，提高存活率，可能与造血干细胞的动员有关。有研究表明[5-7]，造血干细胞存在于骨髓HSCs龛内，通过相互粘附锚定。To LB等[5]研究表明G-CSF可通过巨噬细胞介导和肾上腺素能的交感神经通路动员HSCs，通过减少骨髓中特定的巨噬细胞，释放蛋白水解酶来切割趋化因子，使其失活，同时激活补体级联反应及溶栓途径，从而减弱粘附；另一方面，G-CSF可增加交感神经通路介导的HSCs释放的昼夜规律峰值。Pierce H等[8]研究发现，G-CSF可能通过骨髓微环境中毒蕈碱的受体Ⅰ型信号传导途径诱导的HSC迁移，且在中枢神经系统中通过下丘脑-垂体-肾上腺轴来调节来自骨髓中的HSC动员，长期调控中枢神经系统中HSC的迁移，从而实现神经保护。陆英等[9]采用缺血性脑梗死的大鼠模型发现，腹腔注射G-CSF可减小大鼠梗死灶体积，同时，在脑梗死部位出现CD34+单个核细胞浸润并有向神经样细胞生长分化的趋势。Wu CC等[10]研究通过阿尔兹海默病小鼠模型发现G-CSF可动员HSC及BM-MSC进入血液循环并渗入大脑，而只有动员的BM-MSC参与神经发生，此发现可能为未来内源性干细胞应用打下了基础。

2.2 抗凋亡

G-CSF能够激活多种独立抗凋亡途径，其中包括JAK/STAT、Ras/MAPK和PI3K/Akt信号通路[1]。通过活化Janus激酶进而激活转录因子STAT3，产生信号转导级联，从而抑制细胞凋亡。Ghorbani M等[11]通过一氧化碳中毒脑损伤大鼠模型发现G-CSF可减少皮质区神经细胞凋亡及Caspase 3的表达，同时检测到STAT3和磷酸化的STAT3表达水平升高。另外，G-CSF对PI3K/Akt和细胞外调节蛋白激酶（ERK）家族的ERK1/2具有激活的作用[12]。另一方面，有研究表明，G-CSF在中枢神经系统中对T细胞介导的炎性和脱髓鞘性疾病有潜在的保护作用。Peng W等[13]采用实验性过敏性脑脊髓炎小鼠模型研究提示G-CSF可能诱导自身反应性T细胞的细胞周期从静息的G0或G1期进入到S期，促进自身反应性T细胞凋亡从而抑制其增殖。

2.3 抗炎

众所周知，脑损伤诱发大脑及外周组织的免疫细胞产生炎症反应，来自外周组织的免疫细胞如中性粒细胞、单核及巨噬细胞浸润至脑实质内释放炎症因子引起损伤，而小胶质细胞是中枢神经系统内的免疫细胞，根据不同表型在脑损伤引起的炎症反应进程中起关键作用，Th1表型小胶质细胞释放促炎因子及氧化介质损害神经元，而Th2表型小胶质细胞释放神经营养因子促进脑功能恢复[14]。Song S等[15]通过创伤性脑损伤模型观察到G-CSF通过活化小胶质细胞向受损部位迁移并产生神经营养因子实现修复功能。众多研究表明，G-CSF可抑制炎症介质的产生[16-18]。Strecker JK等[18]在MCAO小鼠模型中证实，单独使用G-CSF治疗可使脑功能得到改善、减小梗死体积、增加血管稳定性、减少炎症反应。Solaroglu I等[17]研究表明G-CSF治疗明显抑制神经元TNFα和IL-1β的表达。Li L等[16]在新生大鼠缺血缺氧模型中发现给予G-CSF治疗后减少促炎细胞因子IKKβ、NF-κB、TNF-α、IL-1β和IL-12、增强抗炎细胞因子IL-10的表达。Lu F等[19]发现在沙鼠模型中，使用G-CSF可降低TNFα水平抑制炎症，减轻急性短暂性前脑缺血的感觉运动缺陷，且呈剂量依赖性，在缺氧缺血早产绵羊模型中也观察到G-CSF减轻脑部的炎症反应[20]。

2.4 诱导神经发生

大脑缺血缺氧后发生神经元的坏死或凋亡，G-CSF与成年神经干细胞表达的G-CSFR相互作用，促进神经发生[21-22]。Song S等[15]在创伤性脑损伤小鼠模型中发现G-CSF的使用可使海马新生神经元数量增加，以及大脑两侧纹状体和额叶皮质中的星形细胞增多症和小胶质细胞增生，从而改善小鼠学习记忆功能。Griva M等[23]发现G-CSF与丰富的周围环境联合刺激在缺氧缺血的新生大鼠模型中进一步增强了其认知功能。老年缺血性脑卒中小鼠模型研究[24]发现，慢性期使用G-CSF与干细胞因子合用增加了梗死区远端树突密度，诱导并重新连接神经元网络。

2.5 促进血管再生

缺血性脑卒中患者通常伴随血脑屏障的破坏及内皮细胞的损伤，G-CSF能够通过促进血管生成及稳定血脑屏障，进而减少梗死面积，影响神经功能的修复。目前研究表明血管内皮生长因子（VEGF）是血管生成的重要因素[22]。Chu H等[25]研究发现在颅内出血的小鼠模型中，G-CSF可通过上调血肿周围VEGF的表达水平，发挥神经保护的作用。多项大鼠大脑中动脉闭塞模型研究证实G-CSF的使用使VEGF及其相关受体表达增强，提示存在促血管生成作用[26-27]。

3 G-CSF在多种神经损伤性疾病中的临床应用

3.1 脑卒中

脑卒中是多种脑血管疾病的严重表现形式，具有极高的致残率和较高的致死率，是当今世界危害人类生命健康的最主要疾病之一[28]。多项体内外实验已经显示G-CSF在实验性卒中模型中可减少病变体积并改善神经运动功能结局。然而，其目前在脑卒中患者中的疗效及安全性仍然不确定。Mizuma A等[29]进行了Ⅱ期临床试验，选取了急性缺血性中风患者49例，采用不同剂量的G-CSF进行治疗，最终根据梗死面积、神经运动功能评分等方面进行评估发现G-CSF有良好的耐受性，但与对照组相比，疗效方面无显著差异。另外，Fan ZZ等[30]的荟萃研究纳入了10项RCT研究，结果提示G-CSF的耐受性良好，有助于提高脑卒中患者的美国国立卫生研究院卒中量表（NIHSS）和改良Rankin量表（mRS）评分、CD34+和白细胞计数的增加。然而，Barthel指数评分及严重不良事件方面没有显著差异。Shin YK等[31]采用G-CSF联合促红细胞生成素（EPO）治疗慢性脑卒中患者，随访6个月后观察到G-CSF联合EPO治疗组较对照组提高了优势手的握力，所有患者未发生心血管及造血系统的不良事件。

3.2 肌萎缩性侧索硬化

肌萎缩性侧索硬化是一种运动神经元进行性丧失的神经退行性疾病，其临床表现多为运动缺陷和肌肉消瘦，多数因呼吸衰竭而死亡，目前仍无行之有效的治疗药物或方案。Duning T等[32]10例确定性ALS患者进行双盲、对照的随机试验研究提示皮下注射G-CSF治疗或是可行的。虽然对临床资料的探索性分析显示无明显疗效，但DTI测量结果提示微结构神经损伤可得到改善。Chio A等[33]的多中心研究也表明G-CSF治疗ALS疗效确切且较安全。经G-CSF治疗的患者促炎细胞因子MCP-1和IL-17水平降低，表明G-CSF诱导中枢性抗炎反应，而这些研究可能对使用生长因子治疗ALS的进一步临床试验产生重大影响。

3.3脊髓损伤

脊髓损伤是一种常见的创伤性疾病，其病理生理表现为直接挫裂和压迫为特点的初次机械损伤和随后数分钟内即发生的可以持续数天的细胞、分子水平的二次损伤，包括炎症渗出、神经元坏死和凋亡等，导致患者出现神经麻痹和瘫痪[34]。急性期时G-CSF可抑制神经细胞凋亡和炎性细胞因子的表达[35]；亚急性期，Takahashi H等[36]研究表明G-CSF通过动员外周血中的干细胞抑制脊髓损伤引起的凋亡及脱髓鞘，促進血管再生，改善肢体功能。基于这些发现，多项研究[37， 38]进行了Ⅰ/Ⅱa期临床试验，提示G-CSF的使用是安全有效的，且能够改善神经功能的恢复。Ropper AE等[39]在24例胸段脊髓损伤患者中发现，与对照组相比，G-CSF组肌肉力量和疼痛感觉明显改善。

4 G-CSF在新生儿缺氧缺血性脑损伤实验中的研究

缺氧缺血性脑损伤（hypoxia ischemia brain damage，HIBD）是由脑血流破坏和缺氧引起的，新生儿的大脑防御功能尚不完善，较成人更容易受到缺血缺氧的影响，导致神经系统损伤（如学习障碍、癫痫、智力低下、脑瘫等）甚至死亡风险增加。在HIBD的新生动物模型中，粒细胞集落刺激因子能通过抗凋亡、抑制皮质酮合成、减轻炎症、稳定血脑屏障等作用改善神经功能[16，40，41]。Fathali N等[42]在HIBD新生大鼠模型研究表明，皮下注射G-CSF能够促进细胞生长，防止脑萎缩，改善感觉、运动协调性、记忆力等结局。Charles MS等[40]发现G-CSF可以通过激活JAK2 / PI3K / PDE3B通路抑制皮质酮合成从而减小新生鼠脑梗死面积。Li L等[16]在HIBD新生大鼠模型中发现G-CSF可能通过激活PI3K/Akt继而使GSK-3β失活来下调炎症因子的表达和稳定血脑屏障。另外，在Doycheva DM等[43]的研究中证实G-CSF联合抗中性粒细胞抗体治疗能够减少梗死体积，改善神经功能的同时可减少嗜中性粒细胞计数，提高药物使用安全性。

5 总结与展望

大量研究表明，G-CSF存在潜在的神经保护作用，但其背后的分子生物学机制是相互作用、相互影响的，目前仍知之甚少，有待进一步明确。在多种神经损伤的动物模型中，G-CSF已经证实通过抗凋亡、抗炎、诱发神经再发生和血管再生等方面发挥神经保护的作用。近年来，国内外采用G-CSF治疗神经损伤性疾病已进行了Ⅰ、Ⅱ期临床试验，在肌萎缩性侧索硬化、脊髓损伤等疾病中观察到安全且改善神经功能结局的作用，而缺血性脑卒中方面暂未见到明显疗效，这仍需要进行大样本对照试验以验证及完善其安全性和疗效，进一步进行长期的纵向研究来明确G-CSF的潜在益处。在缺氧缺血性脑损伤新生大鼠模型中，G-CSF的神经保护作用已得到了多项研究的证明，但仍有必要进一步探索G-CSF使用的安全性、最佳剂量、最佳治疗时间窗、潜在治疗靶点及联合用药等方面。总之，G-CSF作为新型神经保护剂之一，在多种神经损伤性疾病的治疗及改善预后方面具有强大的临床前景。

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（收稿日期：2018-01-12）