氢核磁定量分析技术测定人参皂苷Rd对照品含量的研究

闫慧娇，王志伟，林云良，高红梅，李锋，王晓，耿岩玲

(齐鲁工业大学(山东省科学院)，山东省分析测试中心，山东省科学院中药过程控制研究中心，山东 济南 250014)

人参(Ginseng Radix et Rhizoma)为五加科人参属植物人参(PanaxginsengC.A.Meyer )的干燥根和根茎[1]，传统名贵中药，《神农本草经》列为上品，载其“味甘，微寒，主补五脏，安精神，开心益智，久服轻身延年”，中国药典2015版载其“大补元气，复脉固脱，补脾益肺，生津养血，安神益智”，为广为认可的补益药之一。人参的特征性化学成分主要为四环三萜达玛烷型人参皂苷(ginsenoside)[2]，具有改善免疫功能、提高记忆、延缓衰老、改善心血管功能等作用。

目前人参皂苷含量测量主要使用反相高效液相色谱仪或者超高效液相色谱仪，配合DAD或者ELSD检测器，以及高效液相色谱串联质谱法进行测定[3-7]。这些分析测试方法均需要与标准品对照，且目标物与杂质色谱响应值的差异，可能使其准确性受到一定影响。氢核磁定量分析技术(quantitative hydrogen nuclear magnetic resonance spectroscopy)是基于核磁共振原理的一种定量分析方法，其原理是不同化学环境的氢原子的共振峰面积，只与其原子数目有关[8]。方法简单、快捷，不破坏样品，可以不使用待测组分的对照品，而使用已知含量的普通化学物质为参比，相比于高效液相色谱法、气质及液质联用等定量技术具有独特的优势。随着核磁灵敏度的提高，定量核磁技术的准确度已被广泛用于化学对照品，中药材等的定量分析[9-11]，先后被美、英及欧洲药典收录[12-13]，《中国药典》自2010版[14]也已收录该方法。但目前没有运用氢核磁定量分析技术对人参皂苷含量测定的相关报道。本研究采用核磁共振内标法测定了人参皂苷对照品的含量，建立了在无需使用对照品的情况下对人参皂苷进行质量控制和含量测定的方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Bruker BioSpin 400 MHz NMR spectrometer(德国Bruker公司)；Sartorius SQP精密天平(德国Sartorius公司)；单通道可调微量移液器(德国Eppendorf公司)；Aglient 1260 HPLC(配Aglient 385 ELSD检测器，美国Aglient公司)。

氘代二甲亚枫(氘代度>99.9%，美国CIL公司)；氘代D2O(氘代度>99.9%，美国CIL公司)；苯甲酸(Pcode 1002325760，纯度99.5%，美国Sigma公司)；人参皂苷Rd对照品。人参皂苷Rd和苯甲酸的结构见图1。

图1 人参皂苷Rd和苯甲酸的化学结构式Fig.1 Chemical structure of ginsenoside Rd and benzoic acid

1.2 实验条件

核磁定量实验要求所有测试图谱均在同一测试条件下完成。本实验核磁共振(NMR)采集条件：测定温度25 ℃，观测频率400.13 MHz，脉冲序列zg，脉冲宽度11.800 0 μs，采集时间4.089 4 s，测定样品的NMR谱图。

考察累加次数设定为8、16、32、64、128，实验结果显示累加次数的改变对样品定量峰与内标物定量峰积分面积比值无明显影响，所以选择累加次数32。见图2a。

考察弛豫时间设定1 、3 、5、10 、20 s时被测样品定量特征峰的峰面积，选择峰面积不再增加的值为实验参数，确定弛豫时间为5 s。见图2b。

1.3 实验方法

式中，ws为样品的质量分数；wr为内标物质量分数；As和ns分别为被测定样品的定量峰积分面积及定量峰包含质子数；Ar和nr分别为内标物质的定量峰积分面积及定量峰包含的质子数；Ms为被测样品分子质量；Mr为内标物质的分子质量；ms为样品的质量；mr为称取的内标物质量。

a 累加次数考察图谱；b 弛豫时间考察图谱。图2 实验条件考察的图谱Fig.2 Determination of experimental conditions using 1H NMR spectrum

2 实验结果

2.1 氘代溶剂、内标物和定量峰的选择

2.2 线性关系考察

制成6种不同浓度的待测样品溶液，依照1.2的核磁共振采集条件，测定样品的1H NMR谱。分别测定人参皂苷Rd和苯甲酸定量信号峰积分面积，具体结果如表1所示。

以人参皂苷Rd、苯甲酸1H NMR定量峰面积比为纵坐标y，以人参皂苷Rd、苯甲酸质量比为横坐标x做线性关系图，得回归方程为y=0.065 8x+0.004 5，相关系数R=0.997 8。结果表明，采用氢核磁定量技术对人参皂苷Rd的含量进行测定，线性关系良好。

a 人参皂苷Rd部分H谱(dDMSO)；b 人参皂苷Rd和苯甲酸混合物(dDMSO)；c 人参皂苷Rd和苯甲酸混合物(dDMSO+D2O)。图3 核磁共振氢谱法测定人参皂苷Rd含量的图谱Fig.3 Determination of ginsenoside Rd using 1H NMR spectrum

表1 人参皂苷Rd和苯甲酸的质量及峰面积积分值Table 1 Mass and integral value of peak area of Ginsenoside Rd and benzoic acid

2.3 精密度实验

取2.2项下的3号样品，在选定的同一实验条件下，连续测定6次，人参皂苷Rd和苯甲酸定量峰的积分面积的相对标准偏差分别为0.97%和0.85%，表明重复性好。

2.4 稳定性实验

取2.2项下的3号样品，分别于0 、2、4 、6 、8 、10 h测定其人参皂苷Rd和苯甲酸定量峰的积分面积的相对标准偏差，为0.77%和0.68%，表明样品溶液在10 h内测定稳定。

2.5 加样回收率实验

采用加标回收率方法测定不同浓度人参皂苷Rd的回收率，结果显示，120%，100%及80%的加标量的回收率分别为98.69%，102.54%，101.01%，平均回收率为100.75%，相对标准偏差为1.92%，说明该法准确性良好。

2.6 样品测定

取3个批次的人参皂苷Rd对照品，依照上述1.2和1.3实验条件和实验方法，测定对照品与苯甲酸特征峰的峰面积，按照1.3公式计算，可得人参皂苷Rd对照品的绝对质量分数，同时采用高效液相峰面积归一化法测定其相对质量分数。测定结果如表2所示。从表2数据对比可看出，HPLC法测定得到的人参皂苷Rd的质量分数略高于氢核磁定量法，主要是由于人参皂苷Rd对照品中残留溶剂及残留水分无色谱响应，而氢核磁定量技术测定时去除了人参皂苷Rd所含溶剂及水分，只测定了绝对含量。

表2 3批人参皂苷Rd对照品含量测定结果(质量分数/%)Table 2 Determination result for the control content of ginsenoside Rd

3 结论

实验结果表明，采用氢核磁定量技术对人参皂苷Rd含量进行测定，线性关系、精密度和稳定性均良好。氢核磁定量技术不依赖色谱分离，基于质子的响应而实现定量，信号无选择性响应。定量核磁技术相比于经典的高效液相色谱法、气质联用、液质联用等方法，不依赖于被测物的高纯标准品进行定量分析，不需要绘制标准曲线[16]。此外，该方法同时可体现提取物结构信息，可在定量同时具有一定定性特征。然而定量核磁技术也存在着自身的局限性，使用定量核磁则待测物中须有分离度较好信号，若图谱信号重叠，则限制了该方法的应用。随着核磁共振技术的不断发展，氢核磁定量技术在定量分析中也需要进一步研究和发展。