基质金属蛋白酶8和基质金属蛋白酶9基因多态性与冠状动脉粥样硬化性心脏病患病风险的相关性

路轶晴

(西安市第一医院心血管内科，陕西 西安 710002)

冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronary atherosclerotic heart disease，CAHD)是世界范围内死亡和致残的主要原因[1]。中国城市人口CAHD发病率约为1.59%，农村人口CAHD发病率约为0.48%，北方地区高于南方地区。虽然，CAHD的病因复杂，但是，越来越多的研究表明遗传因素在其发病中具有重要作用[2]。已有研究证实，遗传因素占CAHD易感性个体差异的40%～60%[3]。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)是一类依赖锌的内肽酶，可以分解几乎所有的细胞外基质成分[4]。MMP异常表达与多种癌症和疾病的风险相关[5-7]，并且，血清MMP水平可用于疾病的早期诊断[8]。MMP-8可降解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原蛋白，MMP-9可降解Ⅳ型和Ⅴ型胶原蛋白。MMP-8和MMP-9基因有多个遗传变异，已被发现与多种疾病风险相关[9-10]。然而，对于中国汉族人群中MMP-8和MMP-9基因多态性与CAHD患病风险的研究较少。本研究旨在探讨MMP-8和MMP-9基因多态性与CAHD患病风险的相关性。

1 资料与方法

1.1一般资料选择2016年6月至2017年6月西安市第一医院心血管内科收治的CAHD患者为研究对象，病例纳入标准：(1)经冠状动脉造影确诊为CAHD；(2)年龄>18岁；(3)患者之间无血缘关系。排除标准：并发其他心脑血管疾病、肿瘤、肝肾疾病、血液病、自身免疫性疾病、呼吸系统及内分泌疾病的患者。本研究共纳入CAHD患者300例(CAHD组)，男200例，女100例，年龄41～78(55.44±11.35)岁。另选择同期体检健康者作为对照，纳入标准：(1)以体检结果为准，身体健康，资料信息完善；(2)既往无肿瘤、慢性疾病、严重代谢性疾病及内分泌失调等病史；(3)年龄>18岁；(4)受试者之间无血缘关系。本研究共纳入健康者300例(对照组)，男198例，女102例，年龄42～79(57.26±10.98)岁。2组受试者的性别和年龄分布差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究已获得所有受试者知情同意，符合伦理学规定，并通过医院伦理委员会批准。

1.2主要试剂与仪器全血DNA纯化试剂盒(美国Thermo Fisher公司)，iPLEX Gold 试剂盒、MassARRAY质谱仪、MassARRAY RS1000软件(美国Sequenom公司)，GeneAmp 9700聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)仪(美国ABI公司)；SNPStats在线软件(西班牙加泰罗尼亚肿瘤研究所)，Haploview 4.2软件(美国怀特海德生物医学研究所)。

1.3血样采集及DNA提取采集每位受试者外周静脉血5 mL，置于乙二胺四乙酸二钾抗凝管中，现场编号并登记姓名，所有标本采集当天送回实验室，置于-70 ℃冰箱保存，以备DNA提取。采用全血DNA纯化试剂盒进行DNA提取，操作步骤严格按照说明书进行。

1.4基因分型从美国国立生物技术信息中心和HapMap数据库中查询MMP-8和MMP-9基因的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)位点，选择在中国人群具有较高频率的位点(最小等位基因频率≥5%)，最终确定了rs1940475、rs11225394、rs11225395、rs3918249、rs3918254和rs3787268共6个位点。采用MassARRAY SNP 基因分型技术对所选择的SNP位点进行分型。单碱基延伸引物委托上海生工生物工程技术服务公司进行设计和合成。反应在MassARRAY质谱仪中进行，基因分型使用MassARRAY RS1000软件进行。

1.5统计学处理应用SPSS 19.0软件进行统计分析，直接计数各位点的等位基因及基因型频数，2组各位点的等位基因频率分布比较采用χ2检验；应用SNPStats在线软件(http：//bioinfo.iconcologia.net/snpstats/start.htm)评估各SNP位点基因型与CAHD患病风险的相关性[11]；以相对优势比(odds ratio，OR)和95%可信区间(confidence intervals，CI)表示SNP与患病风险的关系；使用Haploview 4.2软件评估位点间的连锁不平衡情况，并进行单体型与CAHD患病风险的相关性分析；P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1候选SNP基本信息MMP-8和MMP-9基因上6个候选SNP位点的基本信息见表1。6个位点均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)。MMP-8基因上的rs11225394位点的等位基因T与降低CAHD患病风险有相关性(OR=0.812，95%CI：0.699～0.932，P=0.033)。MMP-9基因上的rs3918249和rs3787268位点的等位基因T和A与降低CAHD患病风险有相关性(rs3918249：OR=0.734，95%CI：0.613～0.998，P=0.035；rs3787268：OR=0.824，95%CI：0.693～0.978，P=0.024)。

表1 MMP-8和MMP-9基因上6个候选SNP的基本信息Tab.1 Essential information of six candidate SNPs in MMP-8 and MMP-9 genes

2.2候选SNP在遗传模型下与CAHD患病风险的相关性结果见表2、表3、表4、表5、表6和表7。在最佳模型显性模型下，rs11225394位点的C/T和T/T基因型与降低CAHD患病风险有相关性(OR=0.760，95%CI：0.600～0.970，P=0.025)；rs3918249位点的T/C和T/T基因型与降低CAHD患病风险有相关性(OR=0.720，95%CI：0.570～0.910，P=0.005)；rs3787268位点的A/G和A/A基因型与降低CAHD患病风险有相关性(OR=0.740，95%CI：0.590～0.940，P=0.014)。

表2 遗传模型下rs1940475与CAHD患病风险的相关性Tab.2 Correlation between rs1940475 and the risk of CAHD in genetic models

表3 遗传模型下rs11225394与CAHD患病风险的相关性Tab.3 Correlation between rs11225394 and the risk of CAHD in genetic models

表4 遗传模型下rs11225395与CAHD患病风险的相关性Tab.4 Correlation between rs11225395 and the risk of CAHD in genetic models

表5 遗传模型下rs3918249与CAHD患病风险的相关性Tab.5 Correlation between rs3918249 and the risk of CAHD in genetic models

表6 遗传模型下rs3918254与CAHD患病风险的相关性Tab.6 Correlation between rs3918254 and the risk of CAHD in genetic models

表7 遗传模型下rs3787268与CAHD患病风险的相关性Tab.7 Correlation between rs3787268 and the risk of CAHD in genetic models

2.3候选SNP单体型与CAHD患病风险的相关性对所选择的6个SNP位点进行进一步的连锁不平衡分析，并构建单体型，结果显示，MMP-9基因上的rs3918249、rs3918254和rs3787268位点具有强连锁关系，见图1。经过单体型与CAHD风险的相关性分析，结果显示CCA单体型与降低CAHD患病风险具有相关性(OR=0.640，95%CI：0.340～0.950，P=0.026)，见表8。

图1 MMP-9基因上3个候选SNP的连锁不平衡图Fig.1 Linkage disequilibrium diagram of the three candidate SNPsin MMP-9 gene

表8 MMP-9基因候选SNP的单体型与CAHD患病风险的相关性Tab.8 Correlation between haplotype of candidate SNPs in MMP-9 gene and the risk of CAHD

3 讨论

CAHD发病率较高，其发病机制非常复杂，主要分为环境因素和遗传因素。遗传因素在其发病中具有重要作用，而CAHD相关SNP风险位点的鉴定有助于CAHD高危人群的早期筛查。本研究共挑选了MMP-8和MMP-9基因上的6个SNP位点并检测其多态性，研究其与CAHD风险的相关性。

MMP是一类锌依赖型蛋白水解酶家族，可参与形态发生、伤口愈合、组织修复和损伤反应等过程。MMP-8也称为胶原酶-2或嗜中性粒细胞胶原酶，可由多种细胞表达，如成熟的嗜中性粒细胞、外周嗜中性粒细胞、内皮细胞和软骨细胞等。MMP-8在炎症疾病中起重要作用[12]。MMP-8通过破坏三重螺旋毛细血管胶原蛋白而引发胶原蛋白降解的第1步。此外，MMP-8也对血管紧张素Ⅰ具有蛋白水解活性。FANG等[13]报道MMP-8能裂解血管紧张素Ⅰ，并将其转化为血管紧张素Ⅱ，后者又诱导内皮细胞表达血小板或内皮细胞黏附分子-1而促进血管生成。本研究结果显示，MMP-8基因上的rs11225394位点的等位基因T与降低CAHD患病风险有相关性，这是首次报道该基因位点与CAHD的相关性，由此推测，rs11225394位点的等位基因C突变为T可能影响MMP-8的功能，从而参与CAHD的相关发病机制；这仍有待于进一步的探索。

MMP-9是细胞外基质代谢酶，研究表明，其表达与动脉硬化斑块形成密切相关[14]。MMP-9会导致血管平滑肌细胞向内膜侵入和迁移，并分泌细胞外基质，从而促进斑块的形成[15]。一项前瞻性研究显示，Ⅱ型糖尿病患者MMP-9水平明显升高，而治疗后血清MMP-9水平显著降低，此外，血清MMP-9水平与Gensini评分呈正相关，提示MMP-9水平与冠状动脉狭窄有关[16]。因此，MMP-9可能是与胰岛素相关心血管疾病发生、发展潜在相关的危险因素。本研究结果显示，MMP-9基因上的rs3918249和rs3787268位点的等位基因T和A也与降低CAHD患病风险有相关性，说明MMP-9与CAHD的发生、发展密切相关，然而其具体机制有待深入研究。

本研究对MMP-8和MMP-9基因上的6个SNP进行分型，这些位点在文献中也曾被报道与多种疾病具有相关性。其中rs11225394和rs3918254与中国汉族人群股骨头坏死风险有关[17-19]。而本研究首次报道rs11225394与CAHD患病风险有关，但是，该结果需要在更大样本量中进一步证实。rs1940475被发现与社区获得性肺炎相关的脓毒症和高加索人群的炎症反应有关[20-21]。rs11225395与波兰人群中的膀胱癌患病风险相关[22]。而rs3918249被检测出与中国汉族人群原发性闭角型青光眼的患病风险和墨西哥儿童的哮喘患病风险有关[23-24]。rs3787268与美国原住民妇女乳腺癌预后显著相关[25]。本研究发现，rs3918249和rs3787268位点与降低CAHD患病风险有相关性，并且，由rs3918249、rs3918254和rs3787268位点组成的CCA单体型与降低CAHD患病风险有相关性。

综上所述，本研究结果表明MMP-8基因上的rs11225394位点和MMP-9基因上rs3918249和rs3787268位点可能是CAHD相关的保护性位点。MMP-9基因上rs3918249、rs3918254和rs3787268等3个位点组成的CCA单体型与降低CAHD风险具有相关性。本研究首次揭示了MMP-8和MMP-9基因多态性与CAHD患病风险的相关性，为后续深入研究MMP与心血管疾病的关系提供了新线索。