哮喘大鼠肺组织线粒体功能变化及其对氧化应激水平的影响

刘慧芳，姜 敏，马红霞

(新疆医科大学附属中医医院呼吸科，新疆 乌鲁木齐 830000)

支气管哮喘(简称哮喘)是一种以气道慢性炎症为特征的异质性疾病，不同程度的通气受限、气道高反应、黏液分泌增多是其主要发病特点，临床主要表现为反复发作的喘息、气促伴或不伴咳嗽[1]。哮喘反复发作可使气道结构重塑，严重影响患者的生活质量，所以深入研究并有效治疗哮喘极其迫切。目前研究已证实，机体内活性氧(reactive oxygen species，ROS)的蓄积是哮喘发病的关键环节[2-3]。机体内95%的ROS来源于细胞线粒体氧化磷酸化。线粒体是一种独立的细胞器[4-5]，是氨基酸、糖、脂肪等营养物质进行氧化并释放能量的场所，其主要功能是氧化磷酸化、合成三磷腺苷(adenosine triphosphate，ATP)，提供直接能量，是自由基产生的主要来源。线粒体功能异常多指由于线粒体数量减少、膜受到破坏、呼吸链受到抑制、酶活性降低等引起的能量代谢障碍、产生ROS进而导致一系列相互作用的损伤过程。任何外源性或内源性病理因素引起线粒体损伤、呼吸链抑制，都会导致氧化磷酸化反应和氧代谢的异常，进而产生大量的ROS和自由基。本研究通过测定哮喘模型大鼠及正常大鼠肺组织线粒体膜电位(mitochondrial transmembrane potential，MMP)、细胞色素C氧化酶(cytochrome C oxidase，COX)活性、ATP水平及血浆8-异前列腺素(8-isoprostane，8-iso)、硫代巴比妥物(thiobarbituric acid reaction product，TBARS)、ROS水平并观察肺组织线粒体超微结构，旨在探讨哮喘大鼠肺组织细胞中线粒体功能及氧化应激水平的变化。

1 材料与方法

1.1实验动物2～3个月龄雄性Sprague-Dawley大鼠24只，体质量(200±50)g，购自新疆医科大学动物中心(动物合格证号：65000700000599)。

1.2主要试剂与仪器卵清蛋白(≥98%)、JC-1 (T4069)、ATP检测试剂盒、COX检测试剂盒购自美国Sigma公司；戊二醛固定液(电镜专用)购自北京雷根生物技术有限公司；TBARS、8-iso、ROS酶联免疫吸附试验检测试剂盒购自北京安迪华泰科技有限公司。酶标仪、分光光度计、常温离心机、低温离心机购自美国Thermo公司；热恒温培养箱购自上海精宏实验设备有限公司；流式细胞仪购自德国Merck公司。

1.3动物分组及处理将所有大鼠随机分为哮喘模型组和正常对照组，每组12只。哮喘模型组大鼠第1、7天给予100 g·L-1卵清蛋白溶液1 mL腹腔注射致敏；第15天给予30 g·L-1卵清蛋白溶液雾化激发，每日1次，每次30 min，连续15 d，致敏后大鼠出现气促、鼻翼翕动、喷嚏、腹肌快速收缩等典型哮喘样发作样症状即为造模成功。正常对照组大鼠清洁动物房内室温下常规饲养。

1.4标本采集造模成功后，50 g·L-1水合氯醛1 mL·kg-1麻醉大鼠，腹主动脉采血4 mL，3 000 r·min-1离心10 min，取上清液，-80 ℃保存待测。同时分离肺组织，冰盐水冲洗，称取肺组织 100 mg，冰盐水冲洗后，立即用20 g·L-1戊二醛固定，树脂浸透、包埋、聚合，超薄切片，透射电镜下观察肺组织超微结构。再称取肺组织100 mg，冰盐水冲洗后，采用组织匀浆法及梯度离心法提取肺组织线粒体。

1.5大鼠血浆8-iso、TBARS和ROS水平检测采用酶联免疫吸附试验检测法测2组大鼠血浆 8-iso、TBARS和ROS水平，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.6大鼠肺组织MMP、COX活性及ATP水平检测采用JC-1荧光探针流式细胞术检测2组大鼠肺组织MMP，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行；采用COX检测试剂盒和ATP检测试剂盒检测肺组织线粒体中COX活性和ATP水平，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

2 结果

2.12组大鼠肺组织超微结构结果见图1。透射电镜下观察可见，哮喘模型组大鼠肺组织肺泡Ⅱ型上皮细胞肿胀，从基底面脱落；板层体减少、肿胀，线粒体数量减少、肿胀，嵴结构不清；肺泡间隔增厚，可见嗜酸粒细胞、巨噬细胞浸润，红细胞淤积。正常对照组大鼠肺组织肺泡和肺泡Ⅱ型上皮细胞结构正常，肺泡间隔和血管壁无增厚。

A: 哮喘模型组板层体减少、肿胀，线粒体减少、肿胀，嵴结构不清(×6 000)；B : 哮喘模型组肺泡间隔增厚，可见嗜酸性粒细胞、巨噬细胞浸润，红细胞淤积(×5 000)；C: 哮喘模型组肺泡Ⅱ型上皮细胞肿胀、脱落；板层体减少，线粒体减少、肿胀，嵴结构不清(×5 000)；D～F：正常对照组(D、F:×5 000；E:×6 000)。

2.22组大鼠血浆8-iso、TBARS及ROS水平比较结果见表1。哮喘模型组大鼠血浆8-iso、TBARS及ROS水平高于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 2组大鼠血浆8-iso、TBARS及ROS水平比较Tab.1 Comparison of 8-iso，TBARS and ROS levels between the asthma model group and normal control group

2.32组大鼠肺组织MMP、COX活性、ATP水平比较结果见表2和图2。哮喘模型组大鼠肺组织MMP、COX活性及ATP水平均低于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 2组大鼠肺组织MMP、COX活性、ATP水平比较Tab.2 Comparison of MMP，COX activity and ATP level in lung tissue between the asthma model group and normal control group>

A：正常对照组；B：哮喘模型组。

3 讨论

支气管哮喘(简称哮喘)是一种以气道慢性炎症为特征的异质性疾病，机体内ROS的蓄积是哮喘发病的关键环节[2-3，6-7]。机体内ROS增多和蓄积引起气道组织细胞氧化损伤，导致大量炎性细胞聚集、活化，炎性介质释放，血管内皮受损后通透性增加，黏液分泌增多，气道反应性增高。而机体内95%的ROS来源于细胞线粒体氧化磷酸化。生理情况下，蛋白质、脂肪、糖等在细胞质中降解后进入线粒体，经过三羧酸循环，产生的氢离子进入线粒体内膜，在电子传递链(呼吸链)COX的作用下，与氧分子结合进行氧化还原反应生成水和ATP。正常情况下，氧还原为水的反应是无害的，当线粒体受损，COX活性减低，呼吸链受到抑制，1个或2个电子的转移就会造成氧化磷酸化过程的异常，氧化还原反应的不完全导致超氧阴离子等ROS自由基的过度产生，由此造成机体内ROS蓄积和ATP合成减少[8-9]。膜电位是指细胞膜内外的电位差，当ATP的释放减少时，细胞膜内外离子的浓度发生改变，从而导致膜电位的下降。线粒体的氧化磷酸化主要通过线粒体内膜上的电子传递链(呼吸链)进行，机体内主要的ROS自由基均来源于线粒体内膜上呼吸链的氧化磷酸化反应。膜电位能够反映线粒体的活性，而ATP含量可以代表线粒体的功能是否正常，COX活性决定着线粒体呼吸链功能是否受损抑制，是线粒体呼吸链功能的标志。线粒体功能还与线粒体的数量有关，当线粒体数量减少时，可引起线粒体功能降低。线粒体功能障碍可能会导致过量ROS产生，从而导致细胞内ROS蓄积和氧化损伤，促进炎症反应的发生。

哮喘发病的关键环节是ROS自由基的蓄积和氧化应激，由于机体内ROS主要来源于细胞线粒体，因此本研究对哮喘大鼠肺组织超微结构的观察及线粒体功能检测的结果显示，透射电镜下可见哮喘模型组大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞肿胀、脱落；板层体减少、肿胀；线粒体数量减少、肿胀，嵴结构不清；肺泡间隔增厚，可见嗜酸性粒细胞、巨噬细胞浸润，红细胞淤积；正常对照组大鼠肺泡结构正常，肺泡间隔无增厚。哮喘模型组大鼠肺组织MMP、ATP、COX活性较正常对照组显著下降，表明哮喘大鼠肺组织线粒体功能出现障碍，呼吸链受到抑制。哮喘模型组大鼠血浆ROS、8-iso、TBARS均较正常对照组显著升高，表明哮喘大鼠机体内存在ROS类物质的蓄积，与目前的研究[2-3]结果一致。肺组织由于解剖特点，同时受到内源性和外源性ROS的威胁，尽管外源性ROS会导致气道功能损伤，诱发哮喘等各种呼吸道疾病，但当疾病及病理状态已经形成，即使阻断ROS的来源，也无法阻止ROS的持续存在及其对组织的氧化损伤和疾病的进展[10-11]，而这种持续存在的ROS就是由内源性因素维系的，而在内源性因素中，线粒体呼吸作用是最主要的来源，线粒体的有氧代谢主要通过线粒体内膜上呼吸链的氧化磷酸化进行，因此由于线粒体功能障碍和呼吸链的抑制，导致超氧阴离子等ROS自由基的过度产生、ATP的减少及MMP的下降。因此，作者认为，哮喘大鼠存在肺组织线粒体功能障碍，而线粒体功能受损和呼吸链的抑制导致氧化磷酸化的异常，进而导致大量ROS自由基的生成，使氧化/抗氧化失衡。在哮喘发病过程中，线粒体功能障碍可能是引起氧化应激的重要因素。