酵素食品发酵工艺研究

高小跃，杨红澎，张 怡，童应凯

(天津农学院农学与资源环境学院生物技术系 天津300384)

0 引 言

近年来，在日本和我国，酵素已成为电视、广播、新闻等的热门话题，成为保健食品的新宠。酵素是一类特殊的具有催化功能的复杂蛋白质，部分由人体自身合成，部分由饮食补充[1]。新型酵素食品是指通过合理选择食材、益生菌和发酵工艺，可分别形成一种或多种神奇功效，包括：调整免疫应答、抗癌、整肠、消除便秘、减肥、抗过敏等，作为具有生命活力的独特保健品，酵素有着巨大的养生前景。

红薯，学名甘薯，原产于美洲，是世界上公认的物美价廉、粮菜兼用、老少皆宜的健康绿色食品。红薯味道甜美，富含碳水化合物，膳食纤维，胡萝卜素，多种维生素以及钾、镁、铜、硒、钙等多种矿物质，具有抗癌防癌，防治高血压、动脉硬化，降低胆固醇，治疗便秘的作用[2]。因此，研究新型红薯食品是非常必要的。

酸枣仁是鼠李科植物酸枣的干燥成熟种子，分布于我国西北、东北、华北及南方一些地区。酸枣仁具有补肝、宁心、敛汗、生津的功效，用于治疗虚烦不眠、惊悸多梦、体虚多汗及津伤口渴[3]。因为酸枣仁镇静催眠的显著功效，使其受到了越来越广泛的关注，酸枣仁食品越来越受欢迎。

作为未来的保健品新星，酵素食品的发展前景远大，市场价值较高。由于我国对于酵素产品的研究起步较晚，国内没有针对酵素产品出台相关技术标准和质量检测等，导致市面上酵素产品质量参差不齐[4]。本文主要对以红薯、酸枣仁为主要原料的一种新型酵素食品的发酵工艺研究开展研究，确定其最佳发酵工艺条件，为大规模生产该类酵素食品提供借鉴，真正让酵素食品作为保健食品走进人们的生活。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 原料与菌种

原料：市售红薯、酸枣仁。

菌种：尚川酵素益生菌菌粉；植物乳杆菌；干酪乳杆菌；副干酪乳杆菌(佛山市乐伴贸易有限公司)。

1.1.2 培养基

MRS培养基：蛋白胨 10.0,g，牛肉粉 5.0,g，酵母粉4.0,g，葡萄糖20.0,g，吐温80 1.0,mL，磷酸氢二钾2.0,g，醋酸钠 5.0,g，柠檬酸三铵 2.0,g，硫酸镁 0.2,g，硫酸锰 0.05,g，琼脂 15.0,g，pH 值 6.2，121,℃高压灭菌 40,min。

1.2 试验方法

1.2.1 酵素发酵工艺路线

红薯→洗净去皮、切块→榨汁→ 过滤→分装→灭菌→接种→发酵

酸枣仁→粉碎→烘干→加水煮沸→过滤→分装→灭菌→接种→发酵

1.2.2 实验材料前处理方法

1.2.2.1 红薯前处理方法

红薯洗净去皮后，切小块，放入榨汁机中，按红薯∶水为 1∶10比例榨汁；采用 32层纱布过滤，除去红薯渣，按 100,mL/杯分装入三角瓶中，于 121,℃高压灭菌 20,min；灭菌结束，待培养基晾凉后，按正交实验表(见表1)进行接种发酵。

1.2.2.2 酸枣仁前处理方法

酸枣仁于粉碎机中粉碎约 1～2,min，取粉末放入烘箱85,℃烘干8,h，按酸枣仁粉末∶水为1∶25比例煮沸5,min，采用 32层纱布过滤，除去粉末，按100,mL/杯分装入三角瓶中，于121,℃高压灭菌20,min；灭菌结束，待培养基晾凉后，按正交实验表(如表1)进行接种发酵。

表1 L9(34)实验因素水平表Tab.1 Factors and levels of L9(34)orthogonal experiment

1.2.3 测定方法

1.2.3.1 感官

观察外观、香气、整体口感。

1.2.3.2 测定活菌(乳酸菌)总数

将发酵好的液体样品充分摇匀后，用无菌移液管吸取样品 25,mL放入装有 225,mL无菌水的无菌三角瓶中，充分振摇，制成1∶10的样品匀液。

用1,mL微量加样器吸取1∶10样品匀液1,mL，缓慢注入装有 9,mL无菌水的无菌试管中(吸管尖端不要触及稀释液)，振摇试管，换用 1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成 1∶100的样品匀液。另取 1支微量加样器枪头，按上述操作顺序，做 10倍递增样品匀液，每递增稀释1次，即换用1次枪头。

根据样品活菌总数的估计，选择 2～3个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取 0.1,mL样品匀液分别置于 3个 MRS琼脂平板，使用涂布器进行表面涂布。37,℃，厌氧培养 24,h后计数平板上的所有菌落数。从样品稀释到平板涂布要求在超净工作台内遵循无菌操作，15,min内完成。

1.2.3.3 pH值的测定

pH电极使用前用纯水冲洗，用纸吸干水分，电极连接于仪表上，接通电源，开机。

校准：电极放入任意一pH缓冲液中，校准，判断读数稳定后，按确认完成一点校准；放入第 2个缓冲液按校准继续两点校准。

测量：用滴管吸取无菌水反复冲洗电极 3 次，用滤纸吸干表面液体，插入发酵好的液体样品中进行测定，判断读数稳定后，按确定键读数，记录数值。

1.2.3.4 超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定

超氧化物歧化酶，简称 SOD。SOD 一类催化超氧阴离子自由基发生歧化反应，消除体内超氧阴离子自由基，消除活性氧毒性，保护机体不受超氧阴离子自由基攻击的特殊金属酶。研究表明，具有 SOD酶的保健品具有良好的抗衰老、抗疾病、抗癌、抗疲劳和保健强身的功效[5]。

邻苯三酚方法原理：邻苯三酚在酸性环境中稳定，但在弱碱性环境中会发生自氧化反应，邻苯三酚在自氧化时只接受一个电子生成超氧阴离子自由基(O2+O2-)，并在其自氧化过程中以一定速率生成有色中间物，SOD 可以将 O2-歧化分解成 H2O2和 O2，从而抑制了邻苯三酚的自氧化速率。每分钟反应液中SOD抑制50%,反应速率时即为SOD活力单位[6]。

制备样品提取物溶液：分别量取 100,μL的样品溶液于 EP管中，加入 1,mL的 DMSO，充分溶解，备用。

0.1,mol/L tris溶液：称tris 1.211,g加少许蒸馏水溶解，定容至100,mL。

0.1,mol/L HCl溶液：量浓盐酸 50,μL 定容至50,mL。

tris-HCl缓冲液：量取50,mL的0.1,mol/L tris溶液与20,mL的0.1,mol/L HCl溶液混合，用浓盐酸调pH值到8.2，再用蒸馏水定容至100,mL。

7,mmol/L C6H6O3溶液：称 C6H6O30.441,4,g加水定容至100,mL。

试验中样品组为 10,μL的样品提取物溶液加入3,mL pH 值为 8.2的 tris-HCl缓冲液，25,℃水浴20,min，加入 7,mmo1/L的邻苯三酚溶液 3,mL，反应4,min后加入 28,μL 12,mmol/L的盐酸终止反应；空白组中不加样品，其余与样品组相同，样品空白组不加邻苯三酚并以水代替。以 tris-HC1缓冲液为对照在 420,nm测吸光度值。根据抑制率判断样品对 O2-清除的能力。每份样品重复测定3次。

式中：V1反应液总体积；V2测定样品体积；n样品稀释液倍数。

2 结果与分析

2.1 感官分析

外观、香气、整体口感如表2所示。

表2 感官结果Tab.2 Sensory results

2.2 正交实验结果

由于本实验以活菌数高，SOD活性高为最终目标，所以观测指标是以活菌数量和SOD酶活性为主。正交试验中加糖量是为了调节酵素口感，因此，考虑温度、时间、接种量3个因素的影响，活菌数以及SOD活性测定数据如表3所示。

表3 红薯酵素正交实验结果Tab.3 The results of sweet potato enzyme from L9(34)orthogonal experiment

2.2.1 红薯酵素正交实验结果

各个因素的离差平方和 Si反映了各因素对试验结果的影响，由表3可知，对于 SOD酶活力而言，SA＝0.007,1，SB＝0.000,1.SC＝0.007,6，SC＞SA＞SB。对活菌总数而言，SA＝0.169,1，SB＝0.002,6，SC＝0.237，SC＞SA＞SB。即影响因素顺序为接种量影响最大，发酵温度影响次之，时间影响较小。

分析表4、表5。取临界值 F0.05和 F0.10之间的作为显著性判断标准，对于 SOD 酶活力，F0.05＞F0.10＞FA，F0.05＞F0.10＞FB，FC＞F0.05＞F0.10，对于活菌总数，FA＞F0.05＞F0.10，F0.05＞F0.10＞FB，FC＞F0.05＞F0.10，由方差分析可知，因素 A、B、C 对实验结果都有显著影响，其中，C因素影响特别显著，因素 A、B次之。对于因素 D，因红薯中富含碳水化合物，加糖量为2%,时，口感较佳，即可满足大多数人口感。

表4 红薯酵素SOD酶活力方差分析表Tab.4 Variance analysis of SOD enzyme activity of sweet potato enzyme

表5 红薯酵素活菌总数方差分析表Tab.5 Analysis table of variance of total number of yeast living bacteria

2.2.2 酸枣仁酵素正交实验结果

由表6中 Si值可知，对于 SOD酶活力而言，SA＝19.97，SB＝3.25，SC＝39.5，SC＞SA＞SB，即影响因素顺序为接种量影响最大，发酵温度影响次之，时间影响较小。对活菌总数而言，SA＝0.240,4，SB＝0.004,6，SC＝0.208,6，SA＞SC＞SB。即影响因素顺序为发酵温度影响最大，发酵接种量影响次之，时间影响较小。

表6 酸枣仁酵素正交实验结果分析Tab.6 The results of jujube kernel enzyme from L9(34)orthogonal experiment

分析表7、表8。取临界值 F0.05和 F0.10之间的数值作为显著性判断标准，对于 SOD 酶活力，F0.05＞F0.10＞FA，F0.05＞F0.10＞FB，F0.05＞F0.10＞FC，对于活菌总数，FA＞F0.05＞F0.10，F0.05＞F0.10＞FB，FC＞F0.05＞F0.10，由方差分析可知，因素A、B、C对实验结果都有显著影响，其中，A因素影响特别显著，因素C、B次之。由于因素A、C显著性均大于B，因子A、C应选择活菌数及SOD值最高的A3、C3，因子B虽然在 B1时 SOD酶活最高，但与 B2时相差不多，而B2时活菌数最高，所以选择 B2，对于因素 D，在加糖量为4%,时，口感适中。

表7 酸枣仁酵素SOD酶活力方差分析表Tab.7 Variance analysis of SOD enzyme activity of jujube kernel enzyme

表8 酸枣仁酵素活菌总数方差分析表Tab.8 Variance analysis of the total number of active bacteria of jujube kernel enzyme

3 结 论

综合方差分析及整体感官，红薯酵素的发酵工艺条件为：温度42,℃，发酵时间8,h，接种量为1.5%，加糖2%；配料比红薯∶水为1∶10。酸枣仁酵素的发酵工艺条件为：温度 42,℃，发酵时间 8,h，接种量为1.5%，加糖4%；配料比酸枣仁粉∶水＝1∶25。