正虚邪恋型体表瘘管大鼠模型的建立

闵 丽，万伯顺，童贻捷，陈 龑，张少军，王秋平，高洪娣，张 辉，熊国华，应光耀

瘘管是连接空腔脏器与体表或空腔脏器之间的病理性管道，通常有2个以上开口。瘘管属于中医“漏”的范畴。漏的中医辨证分型分为湿热下注型、阴液亏虚型以及正虚邪恋型[1]。在临床上，以正虚邪恋型最为难治。这部分瘘管手术后易形成慢性难愈性创面，愈后易复发，严重影响患者的生活和工作质量。建立正虚邪恋型瘘管动物模型，是对此类瘘管进行临床疗效以及药效评价的前提。本实验采用环磷酰胺腹腔注射、皮下埋置带菌弹簧纱条的方法建立大鼠模型，通过检测大鼠免疫细胞，证实该实验方法可建立稳定性好、重复性高的正虚邪恋型体表瘘管模型。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级SD大鼠16只，雄性，体质量（280±20）g。上海公共卫生临床中心实验动物中心提供，饲养于生物安全二级实验室标准的IVC系统大鼠独立通气笼中。笼内相对湿度40%～60%，温度 18～25 ℃。121 ℃、30 min高压灭菌专用垫料、饲料及饮水。

1.2 菌株与菌液 临床分离的金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌，由上海公共卫生中心生物安全二级实验室鉴定并提供。采用细菌基础培养基培养细菌至对数期，将细菌与30%甘油生理盐水混合，–80℃冻存。使用时将冻存的菌液复苏，将对数期生长的菌液稀释成9×108cfu/mL浓度，将金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌混合，4 ℃保存。

1.3 自制弹簧纱条 选用3 cm长，外径为0.4 cm的不锈钢弹簧，0.5 cm×12 cm的医用纱条，将纱条对折成3 cm长穿入弹簧内，高温消毒。

1.4 试剂与仪器 RPMI-1640培养液、Hepes、胎牛血清购自美国Gibco公司；PMA、Ionomycin购自美国Sigma公司；BFA购自美国BD公司；Foxp3固定剂/破膜剂、Anti-Mouse/Rat Foxp3 PE、Anti-Rat CD25 APC、Anti-Mouse/Rat IL-17A eFluor® 660、Anti-Rat CD4 FITC 购 自 美 国eBioscience公 司；Mouse anti Rat CD44:RPE购自美国Bio-Rad公司；环磷酰胺注射液（批号14081525）、盐酸氯胺酮注射液（批号1505222）购自江苏恒瑞医药股份有限公司；三目倒置显微镜，日本Nikon公司；低温高速离心机，美国Thermo公司；CO2培养箱，美国Thermo公司；流式细胞仪，美国BD公司；大小鼠抓力测量仪，济南益延科技发展有限公司。

1.5 分组与造模方法 将大鼠适应性饲养1周，按随机数字表随机分为正常组和模型组2组，每组8只。模型组大鼠连续腹腔注射环磷酰胺2 d（每次60 mg/kg剂量，1次/d），静养2 d。第5 d麻醉后放置弹簧纱条，实验前禁食12 h，不禁水。采用氯胺酮按50 mg/kg行腹腔注射麻醉，在大鼠颈背部剃毛备皮，面积约为4 cm×4 cm大小，新洁尔灭酊消毒。在脊柱右侧1.5 cm、颈后1 cm处，用手术剪做一长0.5 cm与脊柱垂直的切口，距此伤口3 cm近尾端做另一长0.5 cm的垂直切口。两处切口均深达皮下肌层，用血管钳自一切口内探入，钝性分离，穿过肌层后于另一切口处探出。引入弹簧纱条，用三角缝针在两端切口分别将弹簧边缘与皮肤缝合固定。用1 mL注射器抽取0.2 mL 9×108cfu/mL浓度的金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌混合菌液，注入弹簧纱条内。分别于第9、16、23、30 d强化腹腔注射环磷酰胺各一次（每次60 mg/kg剂量）。第35 d，拆除大鼠弹簧纱条。第41 d，判断模型是否符合要求。正常组大鼠分别于第1、2、9、16、23、30 d腹腔注射0.9%氯化钠1 mL，不予放置弹簧纱条。

1.6 四诊指标检测 用于判定大鼠正虚变化情况。两组大鼠于入组时及成模时（第41 d）记录四诊指标[2]。测量大鼠体重、腋温、爪和尾数码拍照获取反映红色程度指标r值、抓力以及旷场活动计数，并分别对气虚、血虚、阴虚以及阳虚程度进行计量化检测。

1.7 肉眼观察局部瘘管情况 模型组大鼠在第6 d（放置弹簧纱条后1 d）、第8 d（放置弹簧纱条后3 d）、第13 d（放置弹簧纱条后8 d）、第20 d（放置弹簧纱条后15 d）、第35 d（放置弹簧纱条后30 d，即拆除弹簧当日）、第41 d（成模时）观察分泌物、瘘管局部触诊情况。

1.8 瘘管病理检查 模型组大鼠于第41 d处死，取瘘管组织HE染色后行病理检查。

1.9 Treg（CD4+、CD25+、Foxp3+、Treg） 细胞检测 两组大鼠于第41 d予7%水合氯醛3 mL腹腔注射过量麻醉，处死，无菌取脾。用200目筛网研磨过滤，收集细胞悬液。裂解红细胞后，离心沉淀脾细胞并用PBS清洗3次。调细胞数为1×106/mL铺板，每孔加入RIH buffer补足到200 µL，加入APC标记的CD25抗体及FITC标记的 CD4 抗体，4 ℃避光孵育 30 min。每孔加入固定剂和破膜剂，4 ℃避光孵育45 min。加入PE标记的Foxp3抗体，4 ℃避光孵育2 h。加入PBS，500 g离心5 min。重悬后移至1.5 mL管中，用流式细胞仪检测Treg细胞占CD4+ T细胞的比例。

1.10 Th17（CD4+、CD44+、IL-17+、Th17）细胞检测 脾细胞分离后，以细胞数1×106/mL铺板，每孔加入用RIH buffer配制的刺激剂，37 ℃CO2培养箱中刺激5 h。加入FITC标记的 CD4 抗体和RPE标记的CD44抗体，4 ℃孵育30 min。加入穿孔液，4 ℃孵育45 min。加入IL-17A抗体，4 ℃孵育2 h。加入PBS，500g离心5 min。重悬后移至1.5 mL管中，用流式细胞仪检测IL-17占CD4+ T细胞的比例。

1.11 成模标准 需同时符合以下3项条件。（1）动物活动状况：大鼠一般情况表现为皮毛膨松、易于捕捉、腋温降低、活动减少。（2）证候标准：四诊计量化辨证为气虚、血虚、阴虚或阳虚，可同时合并2种或2种以上虚证。（3）实验室指标：瘘管病理检查符合慢性炎症的病理诊断。

2 结果

2.1 一般情况 模型组于放置弹簧后2 d死亡1只。第41 d，模型组大鼠表现出皮毛膨松、行动迟缓、爪色变淡等虚证证候，正常组无上述表现。

2.2 虚证程度 第1 d入组时，正常组和模型组气虚、血虚、阴虚以及阳虚程度比较均无统计学差异。第41 d成模时，模型组气虚、血虚、阴虚以及阳虚程度均明显低于正常组，与正常组比较，均有统计学差异（P＜0.05或0.01）。见表1。

表1 2组大鼠虚证程度比较（）

表1 2组大鼠虚证程度比较（）

虚证 时间 正常组 模型组 t值 P值n 8 7气虚程度 d 1 1.00±0.10 1.00±0.09 2.65 0.02 d 41 1.01±0.08 0.81±0.10血虚程度 d 1 1.00±0.02 1.02±0.03 5.58 ＜0.01 d 41 1.01±0.02 0.92±0.12阴虚程度 d 1 1.00±0.06 1.00±0.06 5.44 ＜0.01 d 41 1.01±0.06 0.89±0.06阳虚程度 d 1 1.00±0.01 1.01±0.02 5.99 ＜0.01 d 41 1.00±0.01 0.95±0.02

2.3 肉眼观察局部瘘管情况 模型组大鼠在第6至12 d时，见弹簧两端有少量黄白色脓性分泌物，背部皮肤切口处稍红，无明显肿胀。第13 d起脓性分泌物不明显，切口处皮肤稍红。第35 d拆除的弹簧上均包裹有少量黄白色脓性分泌物，拆除弹簧后见大鼠背部瘘口色红，瘘口直径约为4～5 mm。第41 d成模时见背部瘘口未闭合，色淡红，瘘口直径约为2～4 mm，无明显脓性分泌物，两瘘口间可触及条索状硬结，硬结约2～4 mm粗。见图1。

2.4 瘘管病理 模型组大鼠鳞状上皮下纤维结缔组织内见大量急慢性炎细胞浸润，小脓肿形成，肉芽组织增生并见含铁血黄素沉积。提示瘘管壁急慢性炎症（图2）。

2.5 脾细胞Treg、Th17细胞表达 运用流式细胞技术对正常组和和模型组大鼠脾细胞中的Treg细胞和Th17细胞进行检测，模型组Treg明显高于正常组（P＜0.01），模型组Th17明显低于正常组（P＜0.01）。提示模型组较正常组免疫功能低下。见表 2、图 3～4。

图1 大鼠局部瘘管情况

表2 2组大鼠Treg细胞比较（）

表2 2组大鼠Treg细胞比较（）

细胞 正常组 模型组 t值 P值n 8 7 Treg 8.30±1.06 12.03±0.76 7.71 ＜0.01 Th17 3.38±1.04 1.26±0.27 5.18 ＜0.01

图2 模型组瘘管病理

图3 两组Treg细胞比较

图4 两组Th17细胞比较

3 讨论

瘘管是是中医外科常见疾病，经久不愈或间歇性反复发作是该病的特点。中医称瘘管为“漏”。中医学认为，六淫邪毒侵犯，引起脏腑阴阳失调，营卫气血瘀滞，邪浊阻塞经脉，继而发为漏。正虚邪恋型漏属“阴证”范畴，因正气亏损，无以托毒外出所致。临床表现为瘘口流脓液，隐隐作痛，可触及条索状硬结，伴有神疲乏力，自汗盗汗等症[3]，具有难消、难溃、难敛等特点。

建立正虚邪恋型瘘管模型，是对此型瘘管进行实验研究的基础。要在正虚的前提下，同时建立稳定的、重复性强的体表瘘管动物模型有一定的难度。经过前期预初实验的摸索，我们采用环磷酰胺腹腔注射建立正虚动物模型，同时建立体表瘘管大鼠模型[4]，将两者结合建立大鼠正虚邪恋型体表瘘管模型。

目前，用于皮肤外伤感染的动物模型主要有豚鼠、大鼠以及小鼠。豚鼠因个体差异大、皮肤敏感性高、适应性弱以及价格昂贵等原因，不宜建立稳定、有效、经济的感染动物模型。小鼠因背部皮肤面积小、不易行外科手术和术后观察以及伤口自愈能力较强等原因，作为感染动物模型有一定局限性[5-6]。SD大鼠具有经济实用、适应力以及抵抗能力强的优点，被广泛用于药物学、肿瘤学、营养代谢、神经、内分泌等疾病的实验研究中。因此，我们选用SD大鼠作为本实验的模型动物。

环磷酰胺是常用的烷化剂类抗肿瘤药，运用环磷酰胺建立的免疫抑制动物模型已广泛用于临床抗肿瘤药物和免疫功能制剂的药效学评价[7-8]。在环磷酰胺免疫抑制的作用下，可使抵抗力较强、较易恢复的大鼠建立出稳定持久的皮肤外伤感染模型[9]。在中医证候模型的建立中，运用环磷酰胺可建立中医虚证模型[10-11]，该模型变化明显、稳定，涉及到的脏腑和证型较多，有明显的气虚与阳虚证候表现。我们认为，该药是正虚邪恋型模型的首选造模药物。要建立正虚邪恋型模型，需采用高剂量环磷酰胺，以达到免疫抑制的目的来实现。在本实验中，我们选取的造模剂量为60 mg/kg，并在放置弹簧纱条后每周强化注射一次，共强化4次。

Treg是具有免疫抑制功能的CD4+ T细胞亚群，具有免疫无能和免疫抑制性两大功能，是反映机体免疫功能的重要标志[12-13]。Treg占正常人和小鼠的外周血及脾脏组织中CD4+ T细胞的5%～10%，在大鼠中的含量鲜有报道。通过我们的实验发现，CD4+、CD25+、Foxp3+T细胞在正常大鼠脾脏组织中约占6%～10%。模型组大鼠CD4+、CD25+、Foxp3+T细胞上调，提示免疫功能低下。另外，大鼠背部皮下瘘管自造模之初至模型成立均未出现红、肿、热、痛以及大量分泌物的严重炎症反应现象，可能与CD4+、CD25+、Foxp3+T细胞上调后引起免疫抑制，相继抑制炎症反应有关。

辅助性T细胞（helper T lymphocyte，Th）是能辅助T、B淋巴细胞应答的功能亚群。其中Th17细胞是不同于Th1、Th2的细胞亚群，直接参与抗微生物活性[14]。Th17细胞主要产生IL-17，可募集、激活和趋化中性粒细胞至炎症感染部位，清除病原菌并介导炎症反应，导致组织器官的炎性损伤[15-16]。我们的实验结果表明，模型组大鼠Th17细胞（CD4+、CD44+、IL-17+T细胞）所占CD4+ T细胞比率明显低于正常组。说明在免疫抑制的情况下，Th17细胞比率下调，在瘘管局部介导的炎症反应较弱，无法清除病原菌。造模第41 d，模型组大鼠出现皮毛膨松，行动迟缓、爪色变淡等外观虚证表现。在气虚程度、血虚程度、阴虚程度以及阳虚程度等方面，均低于正常组。Treg细胞比例下调、Th17细胞比例上调，背部瘘管形成，瘘管病理提示瘘管壁急慢性炎症，与临床患者瘘管病理表现相同。

综合以上所述，造模后大鼠活动状况、中医证候指标、体表瘘管病理表现以及Treg、Th17含量变化，我们认为，采用环磷酰胺腹腔注射联合金黄色葡萄球菌和大肠杆菌混合菌液注射至大鼠背部皮下弹簧纱条的方法可建立稳定的、可重复的正虚邪恋型体表瘘管大鼠模型。