王传思 谢贻祥 姚 磊 黄鸿武 王永森 吴永军
(安徽医科大学附属六安医院,安徽 六安 237005)
创面修复是一个复杂的生物学过程,血管生成是其关键环节,血管内皮细胞和微血管数目是目前所知评价血管生成的主要指标,临床和动物实验观察发现参黄合剂促进肛周创面组织修复及血管内皮生长因子(VEGF)表达[1-5],但作用机理不明。笔者通过建立大鼠体表瘘管模型,观察参黄合剂对瘘管组织中微血管及血管内皮细胞的影响。现报告如下。
1.1 实验动物 清洁级SD成熟雄性大鼠180只,2月龄,体质量(200±30)g,购于安徽医科大学动物实验中,许可证号为SCXK(皖)2014-0005。每笼饲养5只,自由饮水和摄食,清洁级管理。
1.2 试药与仪器 1)药物。参黄合剂(苦参、黄柏、孩儿茶、五倍子、乌头、樟脑、冰片、制乳没)按 20∶20∶10∶5∶10∶10∶15∶15 质量比混合, 量取混合生药 180 g, 加水500 mL,煎 0.5 h(乌头先煎,樟脑、冰片后下),过滤浓缩至1.0 g/mL的生药煎剂(六安市人民医院中药房提供并制备),4℃保存,给药前复温。0.9%氯化钠注射液(山东齐都药业有限公司生产,国药准字H20113297),高锰酸钾外用片(济南康福生制药有限公司生产,国药准字H37022233)提供。2)试剂。UNEL试剂盒(批号20100902,上海罗氏诊断产品有限公司),抗α-SMA单抗、抗鼠IgG2a-过氧化物酶、苏木精、伊红(批号:20090605上海杰美基因医药科技有限公司),DAB显示液 (批号:20120734,武汉博士德生物工程有限公司)。3)仪器。MV2CP410摄像机、IMS细胞图像分析系统、CCD摄像机、100倍光学显微镜、Nikon 80i荧光显微镜(新飞达光学仪器公司)。
1.3 分组与造模 SD大鼠适应性饲养1周,按随机数字表法分为6组:空白对照组,空白模型组,模型对照组,生理盐水组,高锰酸钾组,参黄合剂组各30只,按文献[6]方法弹簧纱条埋置于SD大鼠颈背部并加混合菌液(金黄色葡萄球菌和大肠杆菌,批号:ATCC25922,由六安市人民医院检验中心提供,1×1010CUF/L)种植污染法,制成体表瘘管模型。20 d后拆除大鼠颈背部弹簧纱条,见瘘口有脓性分泌物者为造模成功,所有均显示造模成功
1.4 干预方法 空白对照组不作任何处理,空白模型组仅作造瘘不做瘘管切开挂线术,模型对照组仅作瘘管切开挂线术,正常喂养,不用任何药物处理。生理盐水组、高锰酸钾组、参黄合剂组于术后第1日开始,每日上午、下午各1次,生理盐水纱条,高锰酸钾(1∶5000)水纱条,参黄合剂纱条分别湿敷创面30 min,总疗程14 d。
1.5 标本采集与检测 1)标本采集:第1、7、14日从每组中随机捉拿10只大鼠,其中5只立即腹腔注射水合氯醛法麻醉,拉脱颈椎法处死,取创面修复部位约0.5 cm×0.5 cm大小肉芽组织,称重待测,另5只作创面肉芽组织的分离、培养。2)微血管数目的检测:取1 g创面肉芽组织,常规固定、石蜡切片、HE染色,在普通光镜下观察创面肉芽组织形态学改变情况并摄片。100倍光学显微镜下在肉芽组织区域内随机法选取3个视野,进行检测,测算3个视野内微血管数目的均值,计算得出数微血管的数目(MVC)。3)VEGF表达量测定:创面肉芽组织切片在室温下与抗α-SMA单抗对切片孵育30 min后,再与抗鼠IgG2a-过氧化物酶结合物反应,用DAB显色、苏木精、伊红复染。采用图像分析系统,采集数字图像,在100倍光学显微镜下,应用计算机系统得到比例因子,选择蓝色阴性区域,红色阳性区域,测定阳性区域面积和光密度值,随机选取每张切片内3个视野,计算出平均值,测定VEGF表达情况,了解VEGF被激活的情况。
1.6 统计学处理 应用SPSS12.0统计软件。计量资料以(±s)表示,每组自身比较t检验,组间用单因素方差分析,计数资料χ2检验,疗效比较Ridit分析。P<0.05为差异具有统计学意义。
2.1 各组肉芽组织微血管数目检测 见图1,表1。普通光镜下观察空白对照组无明显变化,余5组标本均可见大量实性细胞索,由内皮细胞增生形成,毛细血管呈扩张状态,垂直向创面生长,弯曲的毛细血管网以小动脉为轴心,以袢状在周围形成。有大量新生的成纤维细胞在毛细血管周围,可见许多炎性细胞浸润。100倍光学显微镜下在新生的成纤维细胞内可见新生血管及微血管生成,早期成散在分布,后期逐步排列,部分血管内可见血栓。术后1 d各组之间未见明显区别,术后7 d起增多达高峰,术后14 d明显减少,仅见散在分布。空白模型组、模型对照组、生理盐水组之间比较未见明显区别,高锰酸钾组及参黄合剂组与空白模型组,模型对照组,生理盐水组比较增加较明显,参黄合剂组增长最明显,术后1 d每组均可见大量渗出液及炎性细胞,术后7 d均下降明显,术后14 d可见少量,每组之间差别不明显。
图1 各组肉芽组织镜下图像(HE染色,100倍)
表1 各组大鼠瘘管肉芽组织微血管计数比较(±s)
表1 各组大鼠瘘管肉芽组织微血管计数比较(±s)
与空白对照组、空白模型组、模型对照组、生理盐水组比较,*P<0.05;与高锰酸钾组比较,△P<0.05。 下同
组 别 n 术后14 d空白对照组 30 12.74±1.14空白模型组 30 22.18±1.18模型对照组 30 26.29±1.64 13.61±1.52 37.44±2.07高锰酸钾组 30 16.83±1.30* 50.37±3.44* 19.60±2.41*参黄合剂组 30 17.61±1.14* 67.68±4.22*△ 21.63±1.48*△术后1 d 术后7 d 13.66±1.22 12.84±2.19 12.82±1.24 32.46±2.13 12.20±1.48 35.47±2.41生理盐水组 30 26.45±1.95
2.2 各组创面肉芽组织中VEGF表达比较 见图2、表2。100倍光学显微镜下阳性区域呈棕黄色或棕褐色,测定阳性区域面积、阳性比率和光密度值,结果显示术后1 d各组之间未见明显区别,术后7 d空白模型组,模型对照组、生理盐水组之间比较未见明显区别,高锰酸钾组及参黄合剂组与空白模型组、模型对照组、生理盐水组比较增加较明显,参黄合剂组增长最明显,提示随术后创面恢复时间的增加呈递增趋势,且在参黄合剂组中表达明显高于生理盐水及高锰酸钾组(P<0.05)。术后14 d明显下降,各组之间已无明显差别(P>0.05)。
图2 各组创面肉芽组织中VEGF的表达变化(IHC-P染色,100倍)
表2 各组大鼠创面肉芽组织中VEGF表达比较(±s)
表2 各组大鼠创面肉芽组织中VEGF表达比较(±s)
组 别 n 术后14 d空白对照组 30 0.12±0.06空白模型组 30 0.18±0.04模型对照组 30 0.22±0.04术后1 d 术后7 d 0.10±0.02 0.09±0.04 0.22±0.03 0.26±0.01 0.20±0.01 0.21±0.03生理盐水组 30 0.21±0.03*0.27±0.03 0.44±0.03*高锰酸钾组 30 0.31±0.02* 0.56±0.02* 0.23±0.06*参黄合剂组 30 0.34±0.02* 0.70±0.03*△ 0.25±0.05*△
在我国肛门直肠类疾病中,肛瘘发病率达1.67%~3.60%,由于肛瘘创面所处位置的关系,保守治疗效果不佳,手术仍是目前较主要的治疗方法,加之开放性创面,修复缓慢[7]。创面修复虽是多种细胞因子参与调控的复杂的细胞活动,但发挥了十分重要作用的VEGF是激活血管内皮细胞的首要步骤。VEGF是一种血管内皮细胞的有丝分裂原,具有高度特异性,能特异性作用于血管内皮细胞生成微血管,从而促进血管生成[8]。目前人们已经发现了很多促血管生成因子,在已发现的促血管生成因子中,VEGF在生理性及病理性血管新生过程中的作用尤为重要[9]。VEGF又称为血管渗透性因子,是一种分子量为39 kD的分泌性糖蛋白,能诱导内皮细胞分裂增殖,增加微血管的通透性,改变细胞外基质,促进内皮迁移等[10]。在很多正常动物和人的成熟器官中VEGF低水平表达,较高水平表达于创面血管生成,或部分组织器官发育过程中[11]。VEGF主要维持血管密度和通透性,参与血管再生如细胞基质降解、增殖内皮细胞、分化与吻合毛细血管等过程[12];VEGF主要由浆细胞、巨噬细胞和成纤维细胞分泌,结合受体含激酶插入功能区受体(KDR)结合fms样酪氨酸激酶(KDR/Flk-1),磷酸化受体蛋白酪氨酸残基,促进内皮细胞的分裂增殖;而肉芽组织的基质和毛细血管网络形成,主要由纤维蛋白原和血浆蛋白,作用于细胞基质形成纤维凝胶[13]。VEGF能使各种蛋白分解酶等释放,毛细血管基底膜降解,微血管内皮细胞集聚,形成胶原凝胶,生成肉芽组织[14]。VEGF在内皮细胞表面的胞外区结合后,进一步酪氨酸激酶让磷酸化,其相应下游蛋白被激活,起到分裂、增殖和迁移内皮细胞,新生细胞的凋亡受到阻止,促进创面修复[15]。
我们通过肛瘘术后的中医系统辨证分析,确立证型为“湿热内蕴,经络瘀阻”,拟定“清热祛湿、活血消肿”治疗大法,命名参黄合剂方名和药物组成。我们已经完成的临床及实验研究结果表明参黄合剂在肛周相关疾病术后应用中,效果显著,能促进炎症消退,减轻术后肿痛,通过基因水平调节创面VEGF的表达,促进组织修复,使术后创面愈合时间缩短,效果显著[1-5]。因此及时将中药参黄合剂应用在肛肠类疾病术后的愈合过程中,能够更好地发挥中医中药的传统优势,在临床治疗方面更为显著。尽管现在该领域研究较多,但都停留在临床观察阶段,没有对调控机制进行深入系统研究,这就明显制约了中医中药在这一领域里的广泛应用。
本次实验创新地建立瘘管术后的动物模型,并将参黄合剂应用于术后创面,在创面修复的不同时期,参黄合剂组创面局部微血管生成明显高于高锰酸钾组、生理盐水组及空白模型组,参黄合剂组VEGF激活表达亦呈现出同样的趋势,创面新生血管生成速度明显增加,创面的愈合速度明显加快,创面愈合质量显著提高,较好地调节了创面修复过程中VEGF的表达;对照组高锰酸钾利用温热效应,促进局部组织血液循环,解除微小血管痉挛收缩,并具有消炎止痛的功效。而中药参黄合剂作用机制广泛而复杂,另一方面,传统熏洗疗法使药物直达病所,温热扩张创面的微血管,加快局部血液循环,促进回流,对白细胞释放蛋白溶解酶起增强作用,创面坏死组织得以快速清除。温热效应起镇痛作用,使肛周肌肉松弛,水肿减轻止痛,减少出血,促进组织修复,使术后创面愈合时间明显缩短。
本次实验表明,参黄合剂对大鼠体表瘘管术后创面修复过程中的血管生成具有明显的促进作用,且优于高锰酸钾,参黄合剂明显促进了创面肉芽组织中VEGF的激活,从而调节了创面肉芽组织中微血管及血管内皮细胞的生成。他人的研究成就以及我们以往的工作积累启发我们得出这样的结论:传统中医中药应用于瘘管术后开放性创面,可以提高创面的血管生成,并且这种对创面细胞和分子调控功能的实现是从调控VEGF激活开始,进而逐步分层实现的。
但是中药参黄合剂对体表瘘管术后创面修复的影响是多系统多途径的,是各种因素综合作用的结果,其他方面的研究,还有待进一步加强。