复合酶法优化地黄多糖的提取工艺研究

王润珍 利楚云 黄小龙（通讯作者）

（1广东省中医院药剂科 广东 广州 510030）

（2广州采芝林药业有限公司 广东 广州 510145）

熟地黄（Radix Rehmanniae Preparata）为中药中常用的补血药，为玄参科植物地黄的新鲜或干燥块茎经加工炮制而成[1]。生地黄具有清热凉血，养阴生津，润肠通便的功效，而熟地黄功效偏于滋补，具有补血滋阴、益精填髓的作用[2]。临床上常用的补血基础方四物汤，就是以熟地黄作为君药。熟地黄多糖是熟地黄中特有的活性成分之一，药理研究表明，熟地黄多糖有增强免疫力、补血、抗突变、抗肿瘤、抗氧化等生理功能[3]。近年来，有关熟地黄多糖的提取工艺[4-9]已有报道，但是关于复合酶法提取熟地黄多糖的提取工艺鲜见报道，复合酶法具有能耗低、操作简单、易实现产业化、条件温和、提取效率高、环境友好等特点，在天然产物的提取中越来越受到重视。因此，本研究通过单因素和L9（34）正交实验设计，以地黄多糖含量为考察指标，以酶解温度、酶浓度、酶解时间及酶解pH对多糖得率的影响为试验因素，优选地黄多糖的提取工艺，为地黄多糖的进一步深入研究提供依据。

1.材料与方法

1.1 试验材料

DK-98-Ⅱ电热恒温水浴锅（天津泰斯特仪器有限公司）；SB-3200DTD超声波清洗器（宁波新芝生物科技有限公司）；UV-1800紫外可见光分光光度计（日本岛津公司）；BP211D电子天平（德国赛多利斯公司）；DGH80-B 恒温干燥箱（北京中西远大科技有限公司）。

地黄购买自北京同仁堂，产地为河南焦作；实验中所用蒸馏水均为市售屈臣氏蒸馏水；葡萄糖（天津市凯通化学试剂有限公司，分析纯）；苯酚、浓硫酸（国药集团化学试剂有限公司，分析纯）；中性蛋白酶（酶活力≥100U/mg）、纤维素酶（酶活力≥400U/mg），（大连美仑生物技术有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 标准曲线的绘制 精密称量葡萄糖对照品20mg置于100mL容量瓶中，溶解并稀释至刻度，混匀后即得0.2mg/mL的葡萄糖标准品储备液。精密吸取适量葡萄糖标准品储备液，用蒸馏水分别稀释至0、10、20、40、80、120、160μg/mL，采用苯酚-硫酸法测定多糖浓度，分别取0.2mL溶液于6个干燥比色管中，向各管中分别加入0.5mL5%苯酚、2.5mL浓硫酸，摇匀，室温下放置20min，以不加标准溶液的相应溶液作空白，在紫外可见分光光度计490nm下测定其吸光度（A）。按照葡萄糖质量浓度（C）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，绘制线性标准曲线，其回归方程为：A=0.7023C-1.9664，R=0.9994。测定多糖质量浓度线性范围是0～160μg/mL。

图1 葡萄糖线性图

1.2.2 样品处理方法 熟地黄药材在60℃烘箱中干燥至恒质量后粉碎，过60目筛，置于干燥皿中密封保存，准确称量熟地黄药材粉末10.0g，加入复合酶，调节pH，水浴加热。反应结束后，沸水浴10min将酶灭活，抽滤，滤液定容至250mL，作为供试品溶液。按照上述方法测定多糖浓度。

多糖收率（%）=[多糖含量/（1000×地黄药材粉末质量）]×100

其中多糖浓度单位为μg/mL，地黄药材粉末质量单位为mg。

1.2.3 单因素实验设计 采用单因素实验考查，以纤维素酶：中性蛋白酶=1:1的复合酶，考查酶解温度（30、35、40、45、50、55、60℃），酶浓度（4.0%、4.5%、5.0%、5.5%、6.0%、6.5%）、酶解时间（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5h）和酶解pH（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5）对地黄多糖提取效果的影响，选择合适的提取条件。

1.2.4 正交试验设计 复合酶法正交试验以酶解温度（A）、酶浓度（B）、酶解时间（C）、酶解 pH（D）为试验因素，每个因素下设计 3 个水平，根据 L9（34）正交表安排试验，以地黄多糖含量为指标，优选地黄多糖的提取工艺。正交试验因素水平见表 1。

表1 正交试验因素水平

2.结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线的绘制

按照葡萄糖质量浓度（C）为横坐标，溶液在490nm处的吸光度（A）为纵坐标，绘制线性标准曲线，其回归方程为：A=0.7023C-1.9664，R=0.9994。测定总糖质量浓度线性范围是0～ 160μg/mL。

2.2 单因素和正交试验结果

单因素结果表明，酶解温度、酶浓度、酶解时间、酶解 pH对于地黄多糖含量均有影响，其中酶解温度小于50℃时，随温度增高，多糖得率增多，温度大于55℃时，多糖得率下降，说明此时酶活性降低。酶浓度在4.5%以下时，得率属于上升状态，而大于4.5%时，复合酶会对地黄多糖进行分解，降低提取效率。酶解时间大于2.0h时，同样也会使多糖分解。复合酶在偏酸性条件下pH 6.0时活性最好。

由表2试验结果可知，对地黄多糖的提取效果的影响顺序为：酶浓度（B）＞酶解温度（A）＞酶解时间（C）＞酶解 pH（D），即复合酶浓度对地黄多糖的提取效果影响最大，酶解温度次之，酶解时间和酶解pH影响较小。以地黄多糖的得率为考察指标，4因素3水平最佳酶解提取工艺条件为：酶解温度55℃，酶浓度4.5%，酶解时间2.0h，酶解pH 6.0时，其提取效果最佳。

表2 正交实验结果及分析

2.3 最佳提取工艺的优化及验证

在此提取工艺条件下，重复三次进行最优提取条件的验证，地黄多糖含量占原药材的 7.58%，RSD=1.77%（n=3）。结果表明，筛选的最佳提取条件基本稳定，有较好的重复性。

3.结论

本文通过复合酶法优化提取地黄多糖工艺，以地黄多糖含量为考察指标，以酶解温度、酶浓度、酶解时间及酶解pH为试验因素，得到最佳酶解提取工艺条件为：酶解温度55℃，酶浓度4.5%，酶解时间2.0h，酶解pH 6.0。在此提取工艺条件下，地黄多糖含量占原药材的7.58%。利用优化后的复合酶法工艺进行地黄多糖提取，具有操作不仅简便、快速，而且重复性、稳定性良好等优点，适用于地黄多糖的规模化提取，为地黄多糖的进一步深入研究提供依据。