不同时间煎煮柴胡对五柴胡饮中柴胡皂苷含量及药效学的影响

辛 国，赵昕彤，李 文，李 鑫，叶豆丹，黄晓巍,3*

（1.长春中医药大学附属医院，长春 130021；2.长春中医药大学，长春 130117；3.吉林省中药生物大分子重点实验室，长春 130117）

五柴胡饮始载于《景岳全书》：“柴胡1～3钱，当归2～3钱，熟地3～5钱，白术2～3钱，白芍半钱，炙甘草1钱，用于中气不足，外邪不散；伤寒，疟疾，痘疮”[1]。柴胡为伞形科植物柴胡Bupleurum chinense DC或狭叶柴胡Bupleurum scorzonerifolium Willd的干燥根，性微寒、味辛苦，具有疏散退热、疏肝解郁等功效[2]。早于明代陶华所著《伤寒六书》中就有对柴胡入汤剂宜先煎的相关记载：“一用和解药，先煎柴胡一二沸，后入余药同煎”[3]。现代研究表明，柴胡的有效成分主要为三萜皂苷类物质柴胡皂苷，不易煎出，故认为柴胡入汤剂宜先煎，但在《中华人民共和国药典》（2015版）中并未对其做出明确阐述[4]。本文现通过观察柴胡先煎时间对五柴胡饮中的柴胡皂苷a和柴胡皂苷d含量变化及药效学的影响，明确五柴胡饮中柴胡先煎的最佳时间，为柴胡的特殊煎煮方法在临床合理应用提供依据。

1 材料

1.1 动物 ICR小鼠，SPF级，雌性180只，雄性60只，体质量18～22 g，由长春亿斯实验动物技术有限责任公司提供，许可证号：SCXK（吉）2016-0003。

1.2 主要药物试剂与仪器 柴胡皂苷a对照品，上海源叶生物科技有限公司，批号B20146；柴胡皂苷d对照品，上海源叶生物科技有限公司，批号B20150；感冒疏风片，吉林龙鑫药业有限公司，批号151008100；去痛片，长春大政药业科技有限公司，批号161235；枸橼酸喷托维林片，天津力生制药股份有限公司，批号1611014.08。LC-2030岛津高效液相色谱仪（日本岛津公司），MS205DU十万分之一天平（梅特勒-托利多集团），DHG-9245A型电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科技有限公司），KQ3200B 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），YSH-A15W6煎药壶（广东小熊电器有限公司）。

2 化学试验

2.1 对照品溶液的制备 精密称取柴胡皂苷a标准品4.00 mg，柴胡皂苷d标准品5.00 mg置于5mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，稀释成含柴胡皂苷a 0.8 mg/mL，柴胡皂苷d 1 mg/mL的对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备 称取柴胡30 g，加500 mL水浸泡30 min，另取熟地黄30 g，白术20 g，当归20 g，白芍5 g，炙甘草10 g。加500 mL水浸泡30 min，分别将柴胡先煎0、5、10、15、20、25、30、35、40 min，9个煎煮时间的五柴胡饮浓缩干燥（80 ℃）至干膏（出膏率约为13.91%）研磨成粉末（过4号筛），取该粉末约0.5 g，精密称定，置100 mL具塞锥形瓶中，加入5%浓氨水甲醇溶液25 mL，于30 ℃水温超声提取0.5 h，放冷，过滤，用20 mL甲醇分2次洗涤容器和药渣，合并滤液，回收溶剂至干。残渣加甲醇溶解，并定容成25 mL，用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液即得9种不同煎煮时间的柴胡供试品溶液。

阴性对照组溶液的制备[5]。取约熟地黄30 g，白术20 g，当归20 g，白芍5 g，炙甘草10 g。加500 mL水浸泡30 min，煎煮20 min，按上述方法制备即得。2.3 色谱条件 色谱柱：INERTSIL ODS-3柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相：乙腈-水梯度洗脱（0～50 min，乙腈浓度由25% 升至90%，50～55 min，乙腈浓度为90%），柱温30 ℃，流速1 mL/min，检测波长210 nm，进样量10 μL。在选定的色谱条件下，柴胡皂苷a、柴胡皂苷d色谱峰与相邻色谱峰的分离度均大于1.5，理论塔板数不低于10 000，拖尾因子符合要求。2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察 精密量取柴胡皂苷α标准品8.00 mg、柴胡皂苷d标准品10.00 mg，用甲醇定容至10 mL[6-8]。以此液为母液，分别精密移取，制成浓度分别为柴胡皂苷α浓度为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL，柴胡皂苷d的浓度为0.125 、0.25 、0.5、0.75、1 mg/mL的溶液，依2.3项下色谱条件进样。以浓度 X（mg/mL）为横坐标，峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线，得出柴胡皂苷α的回归方程为：

柴胡皂苷d的回归方程为：

结果表明，柴胡皂苷α在浓度为0.1～0.8 mg/mL、柴胡皂苷d在浓度为0.125～1 mg/mL 范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.4.2 精密度试验 精密吸取2.1项下制备的对照品溶液10 μL，进行液相检测，连续进样6次。得到柴胡皂苷α的RSD（n = 6）为0.79%，柴胡皂苷d的RSD（n = 6）为0.96%，结果表明，仪器精密度良好[9-10]。2.4.3 稳定性试验 分别在 0、4、8、12、24、48 h精密吸取室温下放置的2.2项下柴胡先煎15 min的样品溶液10 μL，进样测定。以峰面积积分值为指标测定其稳定性，柴胡皂苷α的RSD（n = 6）为0.71%，柴胡皂苷d的RSD（n = 6）为0.93%。表明五柴胡饮中的柴胡皂苷α和柴胡皂苷d在48 h内稳定性良好[11]。

2.4.4 重复性试验 按照2.2项下煎煮6份柴胡先煎15 min的五柴胡饮，并进行样品处理，每份精密吸取10 μL进行检测。以回归方程计算柴胡皂苷α和柴胡皂苷d的含量，其平均值（n = 6）为34.69 mg/mL，RSD （n = 6）为 0.027%[12]。

2.4.5 加样回收率试验 精密称取已知含量为34.25 mg/mL的柴胡先煎15 min五柴胡饮浸膏6份，每份约0.1 g，分别加入相当于样品中柴胡皂苷α、柴胡皂苷d含有量100%的柴胡皂苷α和柴胡皂苷d对照品粉末。按2.2项下的方法制备供试品溶液，进样10 μL测定。得到加样回收率为100.3% ，RSD（n = 6）为1.143%[13]。

2.4.6 样品含量测定 分别吸取2.2项下9个煎煮时间的五柴胡饮，按照2.3项下色谱条件进样10 μL测定。9个样品中柴胡皂苷α和柴胡皂苷d的含量分别为：18.29、22.10、31.67、34.25、30.52、23.69、18.31、15.30、13.43 mg/g。

3 药效学实验

3.1 药物制备 五柴胡饮的制备：称取柴胡60 g，加500 mL水浸泡30 min，另取熟地黄60 g，白术40 g，当归40 g，白芍10 g，炙甘草20 g。加500 mL水浸泡30 min，依2.2项下时间要求进行煎煮，并浓缩至含柴胡浓度为1 g/mL，放凉，备用[14]。

阳性药的制备：去痛片的制备，取药品粉末11.150 g，用水50 mL制成浓度为0.230 g/mL溶液备用。枸橼酸喷托维林片的制备，取药品粉末0.570 g，加水50 mL制成浓度为0.011 4 g/mL溶液备用。感冒疏风片的制备，取药品粉末40.00 g，加水50 mL，制成浓度为0.800 g/mL溶液备用。

3.2 动物分组及给药 镇痛实验，120只雌鼠随机分为12组，每组10只，即模型对照组，感冒疏风片组，去痛片组，不同煎煮时间的五柴胡饮9组（依2.2项下时间要求进行煎煮）。镇咳实验120只小鼠（雌雄各半）随机分为12组，每组10只，即模型对照组，感冒疏风片组，枸橼酸喷托维林片组及不同煎煮时间的五柴胡饮9组（依2.2项下时间要求进行煎煮）。按0.02 mL/g剂量对各组小鼠灌胃给药，模型对照组给予等体积的纯净水，连续给药7 d。

3.3 统计学方法 采用SPSS 21.0软件进行统计学处理。结果以均数±标准差（x± s ）表示，2组间样本均数比较采用t检验，P＜0.05为有统计学意义。

3.4 镇咳实验 镇咳实验各组小鼠（雌雄各半）末次给药1 h后，将小鼠放入雾化器中，以25%氨水定量喷雾引咳，记录各组小鼠的咳嗽潜伏期（首次咳嗽的时间）和2 min内咳嗽次数[15]。结果见表1。

表1 不同时间煎煮柴胡的五柴胡饮对小鼠的镇咳作用（x± s ，n = 10）

3.5 镇痛实验 镇痛实验各组小鼠（雌性）末次给药1 h后，将小鼠置于（55±0.5）℃的智能热板仪上，记录其足底接触热板到出现舔后足或跳跃的时间[16]。结果见表2。

表2 不同时间煎煮柴胡的五柴胡饮对小鼠的镇痛作用（x± s ，n = 10） s

4 小结

本实验结果表明，五柴胡饮中的柴胡皂苷含量随煎煮时间延长而逐渐增加，至柴胡煎煮35 min（即先煎15 min）时候含量最大，之后随煎煮时间延长柴胡皂苷含量降低。可能原因主要为：随着煎煮时间改变，柴胡各有效成分之间可能产生分解反应、聚合反应等，也可能发生了有效成分之间的转化。药效学结果表明，与模型对照组相比，柴胡先煎15 min组小鼠的痛阈时间存在显著性差异（P＜0.01），柴胡先煎10、20、25 min组的痛阈时间明显延长（P＜0.05）；柴胡先煎10、15、20、25 min组均可使小鼠咳嗽潜伏期明显延长（P＜0.05，P＜0.01），其中煎煮35 min组的镇咳效果最为显著。结果表明，五柴胡饮中柴胡皂苷的含量与柴胡的煎煮时间有关，且柴胡皂苷的含量变化直接影响了五柴胡饮的镇咳、镇痛的作用。综上所述，柴胡入汤剂宜先煎，最佳煎煮时间为35 min（即先煎15 min）。